Overall summary analysis

Como ya se expuso en la Introducción de esta Tesis, las principales técnicas que actualmente se utilizan para la tipificación de neumococo presentan una serie de li- mitaciones. Por un lado, la técnica de PFGE —aunque posee una gran resolución y reproducibilidad— es laboriosa, consume mucho tiempo y la comparación de los re- sultados obtenidos entre diferentes laboratorios no siempre es fácil. Por otro, la utili- zación exclusiva de la serotipificación, aunque muy útil en determinados casos, no es aconsejable ya que aislados de un mismo serotipo puede presentar una variabi- lidad genética sustancial. Finalmente, la técnica MLST —la más utilizada actual- mente— es una técnica simple, reproducible y que permite una fácil comparación de resultados entre laboratorios. Sin embargo, el MLST es costoso económicamen- te para los laboratorios clínicos y, al igual que ocurre con aislados del mismo seroti- po, aislados del mismo secuencitipo pueden mostrar mucha variabilidad genética (Silva et al., 2006; Hiller et al., 2010; Croucher et al., 2011). En definitiva, la clasifi- cación ideal de cepas clínicas exige un grado de granularidad tan fino que sólo es alcanzable mediante la secuenciación del genoma completo. Aunque en los últimos años se han reducido los costes económicos y temporales que requiere este tipo de tecnología, gracias a la pirosecuenciación y las herramientas automáticas de en- samblaje de secuencias y anotación de las mismas, la secuenciación rutinaria de genomas completos en el laboratorio clínico no parece factible a corto plazo. Por lo tanto, sería deseable un nuevo sistema de tipificación que combinara la sensibilidad y reproducibilidad del MLST con un menor número de genes con el fin de reducir los costes de la técnica y así poder ser implementada en la práctica diaria de los labo- ratorios clínicos. El nuevo sistema propuesto en esta Tesis consistió inicialmente en la secuenciación de un único gen, típico (aunque no exclusivo) de neumococo como es lytA, con la intención de reducir de manera importante el coste de la técnica así como de poder aumentar el poder de resolución de la misma. Se escogió este gen por nuestros conocimientos sobre su filogenia y peculiaridades, así como porque parecía cumplir las condiciones necesarias para formar parte de un buen sistema de tipificación molecular: las secuencias de los alelos lytA de neumococo presentan una serie de características distintivas respecto a alelos presentes en fagos o en otros SMG. Se consideró adecuada la secuenciación del gen completo ya que po- see un tamaño tal (957 pb) que puede llevarse a cabo únicamente con un par de

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cebadores. Este gen es moderadamente polimórfico, a diferencia de los analizados en el MLST, que por su elevado grado de conservación no son adecuados para di- ferenciar estirpes muy relacionadas pero diferentes. Se han descrito otros genes al- tamente polimórficos en neumococo que podrían ser también candidatos atractivos para un sistema alternativo (o complementario) de tipificación. Sin embargo, tales genes poseen una alta tendencia a sufrir inserciones/deleciones así como variacio- nes en su tamaño en unas cepas respecto de otras, como es el caso de los genes

pspA, pspC y lytB (Brooks−Walter et al., 1999; Ianelli et al., 2002; Moscoso et al.,

2005; Croucher et al., 2011). Además, por su elevado tamaño precisan de más de un par de cebadores para su secuenciación completa e incluso algunos de ellos — por ejemplo, psrP— no se encuentran en todos los aislados de neumococo (Obert

et al., 2006; Croucher et al., 2011) lo que no permitiría una tipificación completa de

la especie.

Como primera aproximación y para saber si el planteamiento era el adecuado, se realizó un análisis in silico. Para ello, se seleccionó como referencia el filograma basado en genoma núcleo alineable de 44 cepas publicado por Donati et al. (2010), considerado el análisis más robusto sobre las relaciones filogenéticas entre aislados de neumococo. Este árbol se comparó con los construidos a partir de la concatena- ción génica de los distintos secuencitipos y de los alelos lytA de las mismas 44 ce- pas. Se observó que la estructura de nodos del árbol construido a partir de los se- cuencitipos, aparentemente, no se correspondía con la del filograma de Donati (Fig. 6). Ello es probablemente debido a que en el MLST se analizan siete genes muy conservados perdiendo, de esta manera, mucha información debido a que el geno- ma de neumococo se encuentra en constante evolución por medio de eventos de recombinación mediante transferencia horizontal. Sin embargo, el filograma con los alelos lytA, no mostró una mayor consistencia (Fig. 7A), seguramente debido a la gran variabilidad que aportan los fagos de neumococo con el gen tipo lytA que po- seen y que recombina con el gen bacteriano. Para intentar mejorar estos resultados se consideró adicionalmente el gen galU, por tratarse de un gen altamente polimór- fico y que podría complementar notablemente el grado de discriminación entre es- tirpes proporcionado por lytA. Al construir el árbol basado en el gen galU de las 44 cepas, las correspondientes a los ST62 y ST180 se agrupaban juntas, al igual que en el árbol de Donati y a diferencia del árbol con los MLSTs (Fig. 7B). Además, con- firmando los resultados previamente descritos en el apartado 1 de Resultados, se observó que los alelos lytA se pueden clasificar en dos familias (A y B) y que ocurre

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lo mismo en el caso de los alelos galU (familias I y II) (Fig. 8). Tomando ambas fa- milias y dependiendo de la combinación de alelos lytA y galU, se clasificaron las ce- pas en cuatro grupos. Al construir un árbol con la concatenación de los genes lytA y

galU de las 44 cepas se observó que las cepas de nodos de profundidad media

tendían a coincidir en el grupo lytA-galU, incluyendo algunos con distintos serotipos y MLSTs, siendo el tipo de alelo galU el más determinante en la topología del árbol. Además, en el filograma basado en el genoma completo, cepas del mismo grupo también se localizaban juntas (Fig. 9). La coherencia encontrada entre el árbol de- ducido del genoma completo y el construido sobre la base de la concatenación de

lytA y galU, llevó a seguir adelante con el intento de validar una secuenciación géni-

ca alternativa al MLST. Para ello, se secuenciaron los genes lytA y galU de 164 ais- lados clínicos. Las secuencias de estos aislados, junto con las disponibles en las BD, se utilizaron para construir filogramas basados en los alelos lytA, galU y en su concatenación. Los resultados obtenidos son equivalentes a los observados con las cepas de Donati y cols. (Fig. 10). A la vista de estos resultados se intuía que la se- cuenciación de únicamente estos dos genes podría ser utilizada como una técnica de tipificación molecular de S. pneumoniae con un coste menor que el MLST y pu- diendo, además, mejorar la problemática de resolución limitada que plantea dicho método. Por lo tanto, se procedió al análisis estadístico de los datos obtenidos.

Para el análisis estadístico se emplearon dos tipos de aproximaciones, continua y discreta. En la aproximación continua se compararon las distancias filogenéticas de cada cepa con respecto al grado de identidad de sus alelos (lytA, galU o ST). Es- ta comparación mostró que las distancias entre los alelos lytA, galU y la concatena- ción de ambos, no se correspondían con las distancias genómicas. Sin embargo, la correspondencia entre el grado de identidad de los STs y las distancias genómicas era mucho mayor (Fig. 11). Por lo tanto, el uso de los alelos lytA, galU o su conca- tenado no es una estrategia de tipificación que representara las distancias reales entre las cepas mejor que la ya establecida mediante el MLST. En la aproximación discreta, se clasificaron las cepas según su alelo lytA, galU o combinación de am- bos; se analizó si cada uno de ellos correspondía con sólo un grupo de neumoco- cos considerando dos niveles: linaje y serotipo. A la vista de los resultados, se pue- de concluir que los concatenados de secuencias lytA-galU y MLST son exactos, pa- ra clasificar neumococos a nivel de linaje, y estadísticamente comparables, a nivel de serotipo. Por su grado preciso de polimorfismo, el sistema lytA-galU resulta ser un método eficaz, basado en clases independientes, para predecir serotipo secuen-

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ciando sólo dos genes, mientras que la pequeña ventaja del MLST conlleva un ma- yor gasto económico, temporal y de esfuerzo humano (secuenciación y análisis de 6 genes en lugar de dos), además de una mayor división del universo de las estirpes neumocócicas.