Parallelisation

En este capítulo incluimos un grupo de anticuerpos que reconocen moléculas que ha sido imposible caracterizar de forma completa y definitiva. Incluyen dos grupos de anticuerpos diferentes, por un lado, los que reconocen moléculas que parecen específicas de un único tipo de células, y por otro, un grupo de anticuerpos que reconocen moléculas presentes en prácticamente todas las células analizadas.

1.1 _{Anticuerpos frente a moléculas específicas de líneas celulares estudiadas}

El desarrollo de anticuerpos que pudieran ser marcadores de células embrionarias humanas ha sido, y lo sigue siendo aun hoy, un objetivo que permitiría una eficiente separación de las células pluripotenciales en los cultivos de células embrionarias. Hasta 2005, y durante más de 20 años, se habían generado diez anticuerpos que podían utilizarse como marcadores de superficie de las células embrionarias humanas y dos que eran marcadores de factores de transcripción presentes en estas células (Laslett et al 2003). Sólo cuatro de los anticuerpos contra receptores reconocen epítopos de los que se sabe el gen que controla la proteína que lo alberga (Kolle et al 2009). La dificultad del objetivo principal de nuestro trabajo se hace más evidente cuando desde 2005 un solo nuevo marcador ha sido descrito mediante el uso de anticuerpos (Choo et al 2008). Nuevas aproximaciones, relacionadas con el análisis del proteoma y transcriptoma de las células embrionarias humanas, han recientemente permitido determinar que son alrededor de 90 los genes que controlan receptores celulares específicos de las células embrionarias humanas. En la actualidad son sólo cuatro los anticuerpos que reconocen epítopos presentes en alguno de estos hipotéticos receptores, por lo tanto será necesario acometer trabajos encaminados a generar los anticuerpos que reconozcan esas proteínas y posteriormente ensayar su uso en los cultivos celulares (Kolle et al 2009). La asignación de nuevos marcadores por medio de anticuerpos ha tenido además

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70  otras complicaciones ligadas al hecho de que determinados anticuerpos pueden

reconocer epítopos conformacionales que pueden variar, o incluso desaparecer, en su expresión sobre la proteína. Un caso bien conocido es el del receptor de células embrionarias conocido como CD133. Los anticuerpos AC133 y AC141, que reconocen un epítopo glicosilado presente en la región extracelular del CD133 fueron considerados útiles como marcadores, sin embargo el epítopo reconocido por los anticuerpos puede o no estar presente en el receptor, y por tanto inducir a error sobre la presencia del receptor CD133 en algunas células (Bidlingmaier et al 2008).

Todo ello ha hecho que nuestro primer objetivo haya necesitado modificarse a lo largo de nuestro trabajo, aunque son varios los anticuerpos que se han generado que pueden ser de valiosa ayuda, debido a su especificidad, en el estudio de las células embrionarias humanas sin llegar a ser marcadores de su pluripotencialidad.

1.2 _{Anticuerpos frente a moléculas presentes en prácticamente todas las}

líneas celulares estudiadas

Aunque los anticuerpos monoclonales se consideran generalmente altamente específicos (véase introducción), en nuestro trabajo hemos producido este tipo de anticuerpos, específicos para alguna molécula que puede estar presente en pocas o muchas líneas celulares (Véase capítulos dos, tres y cuatro de la presente tesis doctoral). En contraste con esta especificidad también hemos encontrado otros anticuerpos que reconocen epítopos presentes en varias moléculas y expresadas en todas las líneas celulares. La explicación más inmediata sería considerar que estos anticuerpos son monoreactivos y reconocen una sola molécula presente en todas las líneas, tal como sucede con los anticuerpos que se van a describir en los capítulos 2 y 3 de la presente tesis doctoral. Sin embargo, desde el desarrollo de los primeros anticuerpos monoclonales se conoce que algunos de ellos, pese a su teórica especificidad,

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pueden reaccionar con antígenos presentes en distintas moléculas. (Gould et al 1983; Kramer et al 1997).

La posibilidad de que un anticuerpo pueda reconocer a varios antígenos requiere por tanto tratamiento separado. El fenómeno de que un anticuerpo pueda reconocer varios antígenos puede ser explicado de dos formas (Bouvet & Dighiero 2000): que el anticuerpo reconozca un “epítopo público” presente en varias proteínas, que podemos llamar “verdadera reacción cruzada” (Chitarra et al 1993) o que el parátopo del anticuerpo debido a su débil afinidad por su epítopo sea capaz de reconocer y unirse a diversas moléculas, en este caso nos encontramos con los anticuerpos conocidos como polireactivos (Notkins 2004; Zhou et al 2007; Elkon & Casali 2008). Un esquema que explica la acción de los anticuerpos polireactivos se presenta en la figura 1.1 sacado de Notkins (2004) (Notkins 2004).

Figura 1.1

clásico modelo de “llave” de la interacción antígeno anticuerpo propone estructuras rígidas de los componentes que interactúan y se ha utilizado durante años para explicar la monoreactividad de los anticuerpos. Estudios recientes sugieren que el “bolsillo” de unión al antígeno es más flexible de lo esperado adaptándose a diferentes configuraciones antigénicas. En la figura se muestra cuatro diferentes antígenos que interactúan con diferentes residuos de aminoácidos dentro del bolsillo de unión al antígeno de una sola molécula de un anticuerpo ampliamente polireactivo. Cada interacción altera el plegamiento o conformación del bolsillo de unión al antígeno de una manera diferente (Notkins, 2004).

“Bolsillo” de unión al antígeno

Antígeno 1

Antígeno 2 Antígeno 3 Antígeno 4

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72  En ambos casos los anticuerpos de clase M tienen un papel decisivo

(Vollmers & Brandlein 2006). La polireactividad desde el punto de vista evolutivo es una característica muy conservada por el sistema inmune ya que anticuerpos polireactivos se dan en el hombre y en el tiburón, una excelente revisión puede consultarse en Notkins A.L. (2004) (Zhou et al 2007). En el presente capitulo describimos a varios anticuerpos monoclonales de clase M que reconocen moléculas presentes en prácticamente todas las líneas celulares empleadas y discutimos sobre su posible reacción cruzada o polireactividad.

En este capítulo describimos por tanto anticuerpos, obtenidos tras la inmunización con extractos celulares de la línea HS181 y que reconocen moléculas presentes en dichas células. Para todos ellos se hará necesario un mayor e intensivo estudio hasta la determinación de los epítopos reconocidos. Este trabajo podrá ser desarrollado de continuar la “Plataforma para la producción de reactivos de la Red-Tercel” que ha sido uno de las consecuencias de nuestro trabajo iniciado como una colaboración entre el CABIMER y la Universidad de Córdoba.