Hasta la fecha, sólo unos pocos trabajos han analizado el papel de los exosomas en la reacción alérgica, sugiriendo que éstos podrían actuar como inmunomoduladores y contribuir a la respuesta inflamatoria. Admyre et al. [2007a, 2008] han demostrado que los exosomas derivados de células B de pacientes alérgicos son capaces de activar células Th específicas y promover una respuesta Th2. Por otra parte, exosomas derivados de macrófagos y DCs contienen enzimas implicadas en la biosíntesis de leucotrienos -potentes mediadores endógenos involucrados en procesos inflamatorios, tales como los asociados a la alergia-, e inducen la migración de granulocitos [Esser et al., 2010]. Dado que los exosomas se han detectado en el BALF tanto de individuos sanos como de pacientes alérgicos [Admyre et al., 2003], el objetivo del siguiente bloque se centró en estudiar si los exosomas derivados de ratones alérgicos podrían jugar un papel en la alergia. Para ello se aislaron y caracterizaron los exosomas derivados del BALF de ratones sensibilizados a Ole e 1 (ExoAle) y se analizó el efecto de su administración i.n. durante el desarrollo de la respuesta alérgica frente a este alérgeno. Por último, se estudió la capacidad de los ExoAle de inducir la sensibilización a Ole e 1 in vivo.
Aislamiento y caracterización físico-química de los ExoAle
Los exosomas se aislaron a partir del BALF de ratones sensibilizados a Ole e 1, 24 h después de la última exposición i.n. al alérgeno, según el protocolo estándar de filtración/ultracentrifugación descrito por Théry et al. [2006]. El rendimiento del proceso fue de 7.9 ± 1 μg de ExoAle por ratón, determinado como proteína total (Figura 40A). No se encontraron diferencias significativas en cuanto al rendimiento de purificación en comparación con los ExoCon y ExoTol (6 ± 1 y 7 ± 1 μg de proteína total/ratón, respectivamente). El análisis al microscopio electrónico reveló que los ExoAle presentaban forma redondeada (Figura 40B), con un tamaño comprendido entre 30 y 45 nm (Figura 40C), lo que concordaba con lo observado para los otros tipos de exosomas derivados del BALF.
La densidad de flotación en gradiente de sacarosa de los ExoAle se determinó, tras analizar las fracciones obtenidas por ultracentrifugación, mediante Western blot empleando un anticuerpo específico frente al “marcador exosomal” flotilina-1, una proteína implicada en la formación de rafts lipídicos [Rajendran et al., 2006; Strauss et al., 2010; Wang et al., 2010b] (Figura 40D). Los ExoAle presentaban una densidad de flotación de 1.12 g/ml, comparable a la descrita para los ExoCon y ExoTol. La presencia de este marcador confirmaba la naturaleza exosomal de estas microvesículas [Théry et al., 2009].
También se confirmó, mediante Western blot, la presencia en los ExoAle de otros “marcadores exosomales”, como CD9 y clatrina (Figura 40E). Además, y de forma similar a los ExoCon y ExoTol, los ExoAle expresaban la proteína del surfactante pulmonar SP-B, sintetizada y almacenada por las células epiteliales alveolares de tipo II. Este resultado sugería que estas células son una de las principales fuentes de los exosomas presentes en el BALF de ratón. Finalmente, para descartar posibles contaminaciones con vesículas derivadas del retículo endoplasmático se empleó el anticuerpo anti-gp96 que reconoce la glicoproteína gp96, una chaperona específica del retículo endoplasmático [Randow et
al., 2001; Han et al., 2010]. La ausencia de marcaje en los ExoAle puso de manifiesto la pureza de la preparación. En este estudio se utilizaron exosomas derivados de DCs (Dex) como control.
Figura 40. Caracterización de los exosomas derivados del BALF de ratones sensibilizados a Ole e 1. (A) Rendimiento de la purificación de los exosomas derivados del BALF por ratón, determinado
como proteína total. ExoCon, exosomas control; ExoTol, exosomas tolerogénicos; y ExoAle, exosomas alergénicos. Los datos corresponde a la media ± SEM (n=20 ratones/grupo) de 6 experimentos independientes. (B) Micrografías mediante TEM, (C) distribución de tamaños y (D) densidad de flotación en gradiente de sacarosa de los ExoAle. Cada una de las fracciones obtenidas tras
ultracentrifugación, se analizó mediante Western blot, empleando el anticuerpo monoclonal específico anti-Flotilina-1. (E) Western blot de los ExoAle (20 μg), tras PAGE-SDS en gradiente y transferencia a
membranas de immobilon-nylon, empleando los anticuerpos específicos anti-CD9, anti-clatrina, anti- SP-B y anti-gp96. Como control se utilizaron exosomas derivados de DCs (Dex, 10 μg).
Espectro FTIR de los ExoAle
El espectro FTIR de los ExoAle era similar al obtenido para los ExoCon, caracterizado por la presencia de 7 bandas de absorción en las regiones asignadas a: lípidos (regiones 1 y 2), proteínas (regiones 3 y 4) y polisacáridos/ácidos nucleicos (regiones 5, 6 y 7) (Figura 41A). Con el fin de evaluar la magnitud de las posibles diferencias en los espectros de los exosomas, las 7 regiones espectrales se integraron y se normalizaron con respecto a la región 1 (2.950-2.880 cm-1), correspondiente a la banda de absorción del enlace carbonilo presente en los lípidos (Figura 41B). Sólo se detectaron pequeños cambios entre los 2 tipos de microvesículas en la región 3 (1.700-1.600 cm-1), correspondiente al enlace amida I. No se encontraron diferencias significativas en las otras regiones analizadas, en ninguno de los espectros adquiridos.
Figura 41. Estudio comparativo mediante espectroscopía FTIR de los ExoCon y ExoAle. (A) Espectro promedio (línea continua) ± SD (línea discontinua) de los ExoCon y ExoAle. Se realizaron 3
experimentos independientes, cada uno por duplicado. Las regiones espectrales estudiadas se indican con números del 1 al 7. (B) Integración y normalización de las regiones espectrales estudiadas con respecto a la región 1, correspondiente a la banda de absorción del enlace carbonilo presente en los lípidos. Los datos corresponden a la media ± SEM (n=6).
Las diferencias observadas en los estudios comparativos mediante FTIR entre ambos tipos de microvesículas podrían dar cuenta de los cambios en el contenido proteico de los ExoAle como consecuencia de la sensibilización alérgica. Sin embargo, debido al solapamiento de algunos picos y a la baja intensidad de otros, esta técnica no es útil a nivel cuantitativo, por lo que son necesarios ensayos más sensibles y específicos [Kazarian & Chan, 2013]. Así mismo, no se descarta el hecho de que existan cambios en otros tipos de biomoléculas en los ExoAle, no detectables mediante esta técnica.
Para poder estudiar si estos cambios se traducen en diferentes propiedades in vivo se procedió a analizar el efecto de la administración i.n. de ExoAle durante el proceso de sensibilización a Ole e 1, mediante el análisis de parámetros que caracterizan el estado alérgico: niveles y tipos de anticuerpos séricos, la respuesta de células T específicas en bazo y la respuesta inflamatoria en pulmón. Como grupos control se emplearon ratones pretratados con ExoCon (sham) y ratones naïve.
Efecto de la administración i.n. de ExoAle sobre los niveles de anticuerpos específicos en suero Los niveles de anticuerpos específicos IgE, IgG1 e IgG2a en suero fueron determinados mediante ELISA (Figura 42). La administración i.n. de ExoAle antes de la sensibilización a Ole e 1 no modificó significativamente los niveles de anticuerpos IgE e IgG1, en comparación con los ratones sham. Sin embargo, como consecuencia de la administración i.n. de ExoAle, los niveles séricos de IgG2a específicos se incrementaron un 46% con respecto a los obtenidos en el grupo sham.
Estos resultados indican que la administración i.n. de ExoAle antes de la sensibilización a Ole e 1 no afecta a la síntesis de anticuerpos IgE e IgG1 específicos - isotipos que caracterizan la respuesta alérgica en ratón [Oettegen et al., 1994; Lei et al., 1996; Wiedermann et al., 1999a], a la vez que se incrementan los niveles de IgG2a.
Figura 42. Efecto de la administración i.n. de ExoAle en los niveles de anticuerpos IgE, IgG1 e IgG2a específicos presentes en suero. Los niveles de anticuerpos IgE, IgG1 e IgG2a específicos
fueron determinados mediante ELISA. Sham, ratones pretratados con ExoCon antes de la
sensibilización a Ole e 1, ratones alérgicos; ExoAle, ratones tratados con ExoAle antes de la
sensibilización al alérgeno; y Naïve, ratones no tratados. Los datos corresponden a la media ± SEM (n=5/grupo). Se muestra un experimento representativo de 2 realizados. n.d., no detectado.
Efecto de la administración i.n. de ExoAle en la respuesta de las células T específicas
Para evaluar el efecto de la administración i.n. de ExoAle antes de la sensibilización con Ole e 1 en la respuesta de las células T específicas de bazo, se analizó el patrón de citoquinas presentes en el sobrenadante de los cultivos de esplenocitos, tras estimularlos con el alérgeno in vitro (Figura 43). Los niveles de IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e IFN-γ fueron determinados mediante ELISA en sándwich. El pretratamiento con ExoAle incrementó los niveles de las citoquinas de tipo Th2 IL-4 (6 veces) e IL-5 (7.5 veces), mientras que los de IL-13 no se modificaron. Por otra parte, los niveles de la citoquina reguladora IL-10 también estaban aumentados (2.5 veces), al igual que los de la citoquina de tipo Th1 IFN-γ (2.5 veces), en los cultivos procedentes de los animales pretratados con ExoAle. Ninguna de las citoquinas analizadas fue detectada en los sobrenadantes de los cultivos de esplenocitos de los ratones naïve estimulados con Ole e 1 in vitro.
Figura 43. Efecto de la administración i.n. de ExoAle en la respuesta de las células T específicas de bazo. Los niveles de IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ e IL-10, se determinaron mediante ELISA en sándwich
en el sobrenadante de cultivos de esplenocitos 48 ó 72 h tras ser estimulados con Ole e 1. Sham, ratones tratados con ExoCon antes de la sensibilización a Ole e 1; ExoAle, ratones tratados con ExoAle
antes de la sensibilización al alérgeno; Naïve, ratones no tratados. Los valores corresponden a la media ± SEM (n=5/grupo). Se muestra un experimento representativo de 2 realizados. n.d., no detectado.
IL-4 e IL-13 son dos citoquinas particularmente relevantes en la inducción y mantenimiento de las enfermedades alérgicas [Finkelman et al., 2010; van Dyken & Locksley, 2013]. Sin embargo, aunque estas citoquinas pueden mediar efectos fisiológicos similares, parecen estar reguladas por mecanismos diferentes y desempeñan distintos papeles in vivo en numerosos aspectos asociados con la alergia. IL-4 tiene un papel dominante en la síntesis de IgE y en la eosinofilia [Munitz et al., 2008; Wills-Karp et al., 1998; Perkins et al., 2006], mientras que IL-13 en la hiperreactividad de las vías aéreas e hiperplasia [Grünig et al., 1998; Wills-Karp et al., 1998]. Además de IL-4 e IL-13, otros factores pueden desempeñar un papel relevante en la reacción alérgica actuando de manera sinérgica o antagónica [Rauh et al., 2005; Pesce et al., 2006; Bosschaerts et al., 2008]. Aunque las citoquinas IL-4 e IFN-γ tienen efectos opuestos y recíprocamente pueden inhibir su producción por las células T, cada una de ellas también puede estimular la producción de la otra. Se ha demostrado que IL-4 induce la síntesis de IFN-γ e IL-10 [Morris et al., 2006], los cuales pueden inhibir ciertos parámetros de la enfermedad, como la síntesis de IgG1, la hiperplasia de las células caliciformes y la hiperreactividad, [Kawano et al., 1994; Huang et al., 2001; Oh et al., 2002]. Otro factor que juega un papel importante en la modulación de la respuesta Th2 in vivo son las citoquinas IL-25, IL-33 y TSLP, secretadas por las células epiteliales [Bulek et al., 2010]. Las desregulación de estas citoquinas origina una inflamación crónica Th2, como la asociada con la alergia. Además de IL-4 e IL-13, la citoquina IL-5 también desempeña un papel importante en la alergia al promover la eosinofilia [Coffman et al., 1989; Holgate et al., 1999; Rothenberg & Hogan, 2006]. Así, el incremento en los niveles de IL-5 inducido por los ExoAle podría favorecer un mayor reclutamiento de eosinófilos a nivel pulmonar en estos animales. En este sentido, Admyre et al. [2007a] han demostrado que los exosomas derivados de células B de pacientes alérgicos inducen la secreción de IL-5 e IL-13 por las células Th2 específicas. Por último, los elevados niveles de IFN-γ podrían contribuir a la fisiopatología de la alergia. Aunque conceptualmente las citoquinas Th1 inhiben el desarrollo de la respuesta Th2 e inducen la síntesis de IgG2a, se ha demostrado que la producción de IFN-γ y TNF por las células Th1 induce apoptosis en las células epiteliales y compromete su función de barrera en la piel y el pulmón, contribuyendo en la fase efectora de la alergia [Akdis et al., 2004a]. En consecuencia, el efecto combinado de varios factores podría traducirse en el patrón de citoquinas y anticuerpos observado como consecuencia del pretratamiento con ExoAle. Por lo tanto, el ratio de citoquinas IL-10 a IFN-γ e IL-4 es el que va a determinar el tipo de respuesta inmune [Akdis et al., 2004b]. Todos estos datos ponen de manifiesto la complejidad de la reacción alérgica que implica diferentes tipos celulares y de citoquinas.
En conclusión, los resultados indican una mayor expresión de citoquinas de tipo Th2 en los animales pretratados con ExoAle. Los niveles de IFN-γ podrían contribuir en la fisiopatología de la alergia.
Efecto de la administración i.n. de ExoAle en la inflamación de las vías aéreas inferiores
Con el objetivo de evaluar el efecto del pretratamiento con ExoAle en la respuesta inflamatoria desencadenada en las vías respiratorias inferiores, se extirparon los pulmones 24 h después de la última administración i.n. de Ole e 1 para su análisis al microscopio óptico, tras la tinción de secciones pulmonares con H&E o PAS (Figura 44).
El examen histológico de las secciones pulmonares de los ratones pretratados con ExoAle mostró una severa inflamación caracterizada por un infiltrado perivascular y peribronquial con linfocitos y
eosinófilos, comparable a la de los ratones sham. Además, el análisis con PAS reveló hiperplasia epitelial con un incremento en las células caliciformes productoras de moco, siendo este efecto ligeramente mayor en los animales pretratados con ExoAle. Por el contrario, las secciones de pulmón de los ratones naïve presentaban una histología normal: parénquima sin infiltrado celular, epitelio cúbico y ausencia de moco.
Figura 44. Efecto de la administración i.n. de ExoAle en la respuesta inflamatoria de las vías aéreas inferiores. (A) Micrografías de secciones de pulmón teñidas con hematoxilina-eosina (H&E) y
ácido periódico-reactivo de Shiff (PAS). Los asteriscos muestran las zonas de infiltración celular y las flechas, zonas de hiperplasia epitelial con células caliciformes. B, bronquio; V, vaso sanguíneo. (B) Inflamación pulmonar y (C) producción de moco. Los datos corresponden a la media ± SEM de 2 experimentos independientes (n=4/grupo). Sham, ratones tratados con ExoCon antes de la
sensibilización a Ole e 1; ExoAle, ratones tratados con ExoAle antes de la sensibilización al alérgeno; y Naïve, ratones no tratados.
Efecto de la administración i.n. de ExoAle en los marcadores de inflamación ADAM-8 y CCL11 El análisis histológico, de carácter semicuantitativo, no permitió detectar diferencias significativas en la respuesta inflamatoria en pulmón como consecuencia del pretratamiento con ExoAle. Sin embargo, el incremento observado en los niveles de IL-4 e IL-5, citoquinas reguladoras de la eosinofilia, nos llevó a analizar otros parámetros asociados con la inflamación en bazo y pulmón, dado que varios estudios han señalado que el aumento en los niveles de IL-4 e IL-5 en bazo suele coincidir con un incremento en los niveles de estas citoquinas en pulmón [Morokata et al., 1999; Amuguni et al., 2011].
El primer marcador de inflamación seleccionado fue la quimioquina CCL11. Esta quimioquina coordina, junto con IL-5, la eosinofilia durante los procesos alérgicos, tanto en modelos animales como en humanos [Mould et al., 1997; Rothenberg & Hogan, 2006]. Además, IL-4 e IL-13, inducen la expresión y secreción de CCL11 por los fibroblastos pulmonares y las células epiteliales y de la musculatura lisa de las vías aéreas [Mochizuki et al., 1998; Li et al., 1999; Moore et al., 2001; Teran et al., 1999]. Los niveles de expresión de mRNA de CCL11 se analizaron, en pulmones y bazos, mediante RT-PCR (Figura 45). El pretratamiento con ExoAle provocó un incremento en los niveles mRNA de CCL11 tanto en pulmón (4.1 veces) como en bazo (31 veces). Este resultado indica la correlación existente entre el incremento en los niveles de IL-4 e IL-5 en los cultivos de esplenocitos y el incremento de mRNA de CCL11 en tejidos. A
este respecto, es importante mencionar que la inflamación alérgica se caracteriza por la producción in situ de IL-5 y CCL11 [Bozza et al., 1994; Larangeira et al., 2001; Penido et al., 2001; Penido et al., 2006]. La producción de CCL11 también se encuentra modulada por ADAM-8 [Paulissen et al., 2011], uno de los genes candidato de asma [King et al., 2004]. ADAM-8, una desintegrina y metaloproteasa, es un mediador de la inflamación de las vías aéreas en la alergia al regular las funciones de los eosinófilos [Chiba et al., 2011] y de otras células inmunes, como DC y macrófagos alveolares [Higuchi et al., 2002; Matsumo et al., 2008; Paulissen et al., 2011]. Por esto, ADAM-8 fue el otro marcador de inflamación analizado en este estudio. La administración i.n. de ExoAle provocó un incremento en los niveles de mRNA de ADAM-8 de 1.4 veces en el pulmón y de 35 veces en el bazo, en comparación con los ratones
sham (Figura 45). Un incremento en la expresión del mRNA de ADAM-8 se ha observado en modelos de
ratón de asma alérgica, mediante dos estudios basados en microarrays genómicos [King et al., 2004; Di Valentin et al., 2009]. ADAM-8 también se encuentra sobreexpresado en las células del esputo de pacientes asmáticos [Foley et al., 2007; Paulissen et al., 2010]. Además, se ha demostrado que la depleción genética de ADAM-8 protege frente al asma [Chiba et al., 2009; Paulissen et al., 2011]. Estos y otros estudios han permitido identificar a ADAM-8 como un marcador y efector de inflamación alérgica.
El incremento en los niveles de expresión de los mRNAs de CCL11 y ADAM-8 indica que los ExoAle promueven la respuesta inflamatoria inducida por el alérgeno a nivel local y sistémico.
Figura 45. Efecto de la administración de ExoAle en los niveles de mRNA de ADAM-8 y de CCL11, en pulmón y bazo. Los niveles de mRNA se determinaron mediante RT-
PCR utilizando la β-actina como gen normalizador. Los círculos negros representan la expresión, definida como 1, de los mRNAs en los ratones Sham; los círculos blancos, la expresión de los mRNAs en los ratones ExoAle y las barras,
la media. Los datos corresponden a 2 experimentos independientes (n=4/grupo).
En conclusión, la administración i.n. de ExoAle antes de la sensibilización a Ole e 1, favorece el desarrollo de la respuesta alérgica frente el alérgeno al inducir una mayor expresión de citoquinas de tipo Th2 y de los marcadores de inflamación ADAM-8 y CCL11. Estos resultados nos permiten sugerir que los ExoAle podrían jugar un papel en la respuesta alérgica. Nuestros resultados están en acuerdo con los publicados recientemente por Torregrosa-Paredes et al. [2012], donde demuestran que los exosomas derivados del BALF de pacientes asmáticos tienen mayor capacidad para promover la síntesis de leucotrienos y citoquinas proinflamatorias -como IL-8- en células epiteliales bronquiales que los de individuos sanos.
Establecimiento de un modelo de ratón alérgico a Ole e 1 basado en la administración de ExoAle Finalmente, se analizó la capacidad de los ExoAle de sensibilizar a ratones frente a Ole e 1. Para ello se ensayaron 2 protocolos de sensibilización que diferían en la ruta de administración de los exosomas: la ruta i.n. versus la i.p.
En un primer protocolo de sensibilización, los ExoAle se administraron vía i.n. antes de la reexposición i.n. al Ole e 1 en ausencia de adyuvante durante 3 días consecutivos. Posteriormente, el estado alérgico se determinó mediante el análisis de los niveles y tipos de anticuerpos específicos en suero y la respuesta de las células T específicas de bazo. Como grupos control se emplearon ratones sensibilizados a Ole e 1, según el protocolo clásico de Marazuela et al. [2008b] -a los que se denominó ratones alérgicos-, y ratones sensibilizados con ExoCon vía i.n.
Determinación de los niveles de anticuerpos IgE, IgG1 e IgG2a específicos de Ole e 1 en suero
Los niveles de anticuerpos IgE, IgG1 e IgG2a específicos presentes en suero fueron determinados mediante ELISA (Figura 46).
Figura 46. Niveles de anticuerpos IgE, IgG1 e IgG2a específicos a Ole e 1, en suero de ratones sensibilizados vía i.n. con ExoAle. Los niveles séricos de anticuerpos IgE, IgG1 e IgG2a específicos se determinaron mediante ELISA. Alérgicos, ratones sensibilizados a Ole e 1, según el protocolo descrito por Marazuela et al. [2008b]. ExoCon, ratones sensibilizados vía i.n. con ExoCon; ExoAle,
ratones sensibilizados vía i.n. con ExoAle; y Naïve, ratones no sensibilizados. Los datos corresponden
a la media ± SEM (n=5/grupo). n.d., no detectado.
Tras someter a los ratones al protocolo de sensibilización descrito no se observó un incremento en los niveles de IgE e IgG1 específicos frente a Ole e 1, ni tampoco en los de IgG2a. Sólo se detectó un