Perception of simplification in FP7 by National Contact Points

De manera general, los biomarcadores de efecto representan cambios a niveles subcelulares, particularmente cromosómicos o moleculares. Entre los eventos cromosómicos, se pueden observar alteraciones estructurales y numéricas. Durante décadas, los ensayos citogenéticos han sido muy utilizados en la evaluación de trabajadores expuestos a mutágenos y/o carcinógenos. Las técnicas citogenéticas asociadas a técnicas moleculares, permiten detectar de forma más precisa las alteraciones producidas en el DNA. Estas alteraciones, además de ser utilizadas para definir consecuencias, a veces

pueden ser empleadas como medidas de exposición (Albertini et al., 1996).

Los ensayos de aberraciones cromosómicas (CA) y el de MN pueden ser destacados como biomarcadores de efecto biológico temprano, así como los ensayos de mutación somática en genes específicos como, por ejemplo, el ensayo de mutación somática en el gen HPRT. Por otro lado, parece existir una buena correlación entre el aumento de la frecuencia de los daños cromosómicos producidos por una determinada exposición y el incremento del riesgo cancerígeno. Así, se ha propuesto que los biomarcadores citogenéticos pueden servir también como indicadores tempranos de riesgo de cáncer (Carrano y Natarajan, 1988; Kyrtopoulos, 2006).

En los estudios de biomonitorización de poblaciones humanas expuestas al arsénico se suelen utilizar como biomarcadores de efecto el ensayo de MN en linfocitos de sangre periférica, en mucosa bucal y en células epiteliales de vejiga (Hughes, 2006); así como las

aberraciones cromosómicas (Mahata et al., 2003) y las mutaciones puntuales en el gen

HPRT (Harrington-Brock et al., 1999). En algunos estudios, también se ha utilizado el ensayo

de SCE como medida de daño citogenético (Lerda, 1994; Seoane et al., 1998; Mahata et al.,

2003).

1.6.1.2.1. El ensayo de micronúcleos

Los MN se pueden observar en células interfásicas y se presentan como pequeños núcleos, con membrana definida y apariencia morfológica similar a la del núcleo principal de la célula. Pueden originarse de forma espontánea o como respuesta a agentes clastogénicos o aneugénicos y consisten en fragmentos cromosómicos acéntricos y/o cromosomas enteros, que durante la división celular no se han podido incorporar al núcleo de las células hijas (Fenech y Morley, 1985).

La utilización del ensayo de MN para cuantificar daño cromosómico data de 1959, cuando Evans y colaboradores demostraron que las radiaciones ionizantes provocaban en las células vegetales un efecto con una clara relación dosis-respuesta. El uso del ensayo como medida de genotoxicidad se propuso por primera vez por Countryman y Heddle en 1976 (Countryman y Heddle, 1976); desde entonces viene siendo realizado con diferentes tipos celulares y ha experimentado distintas modificaciones metodológicas. En 1985, Fenech y Morley desarrollaron la técnica del bloqueo de la citocinesis mediante el uso de

la citocalasina B (Cyt-B), un extracto del hongo Helminthosporium dematioideum que

actúa específicamente bloqueando la citocinesis, sin afectar la cariocinesis. De este modo, el núcleo se divide y el citoplasma permanece intacto, siendo posible identificar fácilmente las células que han sufrido una única división celular por su aspecto binucleado, de las que han experimentado más de una división, por presentar 3 o más núcleos (Fenech, 1993; Kirsch-Volders et al., 2000).

El ensayo de MN con bloqueo de la citocinesis permite evaluar la inducción de MN y también analizar la tasa de división celular. Además, el ensayo de MN complementado con

metodologías de citogenética molecular (hibridación in situ con sondas pancentroméricas,

por ejemplo) permite distinguir el origen citogénetico de los MN, posibilitando evaluar agentes con capacidad aneugénica y/o clastogénica (Fenech, 2000).

En 1999, a través del desarrollo de un proyecto a escala mundial (Programa Internacional

de Micronúcleos Humanos - Human Micronucleus Project) dirigido por M. Fenech y S.

Bonassi, se llevó a cabo la validación del ensayo de MN como un biomarcador eficaz de daño en el DNA. La validación del ensayo consistió básicamente en identificar las fuentes y niveles de variabilidad en la frecuencia basal de los MN y definir un protocolo estándar para la técnica. Los criterios de selección para el recuento de las células binucleadas y para el análisis de los MN se estandarizaron; y entre los posibles factores relacionados con la variabilidad en la frecuencia basal de los MN, parece ser que el sexo, la edad y el consumo

de alcohol son de los más importantes (Zalacaín et al., 2005).

Actualmente, el ensayo de MN se viene utilizando como una de las pruebas de mayor aceptación en la evaluación del riesgo por exposición a potenciales mutágenos y

carcinógenos ocupacionales y ambientales (Natarajan et al., 1994 a; Kirsch-Volders et al.,

2000).

1.6.1.2.1.1. El uso de linfocitos de sangre periférica

Los linfocitos de sangre periférica son células sanguíneas frecuentemente utilizadas con el objetivo de detectar el efecto biológico de una exposición. En general, estas células ofrecen un gran número de ventajas, visto que son muy fáciles de obtener, tienen un ciclo celular corto y bien conocido, representan una población relativamente sincrónica y las técnicas de cultivo están bien establecidas. Además, se pueden considerar como indicadores de exposición general (persisten durante años en el torrente sanguíneo) y, como presentan un metabolismo relativamente bajo, no poseen un mecanismo de reparación tan eficiente, lo que, en cierta manera, es una garantía del mantenimiento del registro de exposición (Carrano y Natarajan, 1988).

En general, la mayoría de linfocitos se encuentran en estado no proliferativo (Go) y, por lo tanto, necesitan ser estimulados para que puedan dividirse y, consecuentemente, manifestar los efectos del daño genotóxico en forma de MNs. El ciclo de división de los linfocitos en cultivo es bastante conocido y, por consiguiente, pueden ser fácilmente estimulados a entrar en división celular en presencia de fitohemaglutinina (PHA). Cabe destacar que sucesivas divisiones celulares pueden llevar a una pérdida de los MN formados y, para evitar una subestima del daño genotóxico inducido, sólo se evaluan las células que después de expuestas hayan sufrido una sola división celular.

El ensayo de MN como medida de genotoxicidad fue inicialmente desarrollado utlizando linfocitos humanos en cultivo. Sin embargo, actualmente la técnica se viene aplicando a

distintos tipos celulares y se emplea como medida de genotoxicidad, tanto en estudios in

vitro como in vivo.

1.6.1.2.1.2. El uso de células de mucosa bucal

Otros tipos celulares como las células epiteliales de la mucosa bucal y nasal, y las células uroteliales, a pesar de sus limitaciones también pueden ser útiles en la detección del daño genético en función del tipo de exposición estudiado. La elección de una metodología de estudio adecuada garantiza resultados más relevantes en la caracterización y prevención

del riesgo genotóxico (Salama et al., 1999; Au, 2007).

Las principales ventajas del uso de los tejidos epiteliales de descamación consisten en que proliferan muy rápidamente y están en constante contacto con el medio de exposición. Además, considerando que el 90% de los cánceres tienen un origen en células epiteliales, el uso de células de descamación del epitelio adquiere un importante papel desde el punto de vista epidemiológico (Cairns, 1975).

El ensayo de MN en células de mucosa bucal fue desarrollado por (Stich et al., 1985) y,

desde entonces, viene utilizándose con éxito en una amplia variedad de células de descamación. El proceso de formación de los MN es común en todas las células; sin embargo, la detección del daño genético ocurrido en la capa basal se realiza a medida en que las células se van exfoliando y alcanzan la superficie. En general, debido al alto grado de renovación celular, el máximo índice de formación de los MN se encuentra entre 1 y 3 semanas después de la exposición. Por otro lado, una vez finalizada la exposición estos

valores disminuyen (Titenko-Holland et al., 1998; Fenech et al., 1999).

El ensayo de MN en células epiteliales de descamación, además de caracterizarse por ser un método no invasivo, rápido y sencillo, también se ha revelado como una medida muy

sensible a los efectos inducidos por genotóxicos ambientales y/o ocupacionales (Tian et al.,

2001; Vuyyuri et al., 2006; Lewinska et al., 2007).

Cabe destacar que los inconvenientes que puede presentar el ensayo de MN en células de descamación siguen siendo, como en linfocitos, la gran variabilidad intra e interindividual

existente, la influencia de factores de confusión y la diversidad en los criterios de

evaluación de los MN (Stich et al., 1985).

1.6.1.2.2. El ensayo de intercambios entre cromátidas hermanas

Los intercambios entre cromátidas hermanas (SCE) consisten en la manifestación citológica de la rotura de doble cadena del DNA y la reunión en sitios aparentemente homólogos entre cromátidas de un mismo cromosoma, fácilmente visualizables en

cromosomas metafásicos (Natarajan et al., 1994 b).

Los SCE fueron inicialmente observados por McClintock en 1938, al comprobar la

dificultad de los cromosomas en anillo para separarse (véase la revisión de Natarajan et al.,

1994 b). Veinte años más tarde (1958), fueron demostrados por Taylor (revisado por Perry y Evans, 1975), llevando a cabo estudios con cromosomas de plantas expuestas a isótopos radioactivos. Posteriormente, se han desarrollado técnicas para distinguir las cromátidas hermanas sin el uso de radioisótopos y, con la aparición de la técnica de tinción diferencial de las cromátidas hermanas basada en la incorporación de un análogo de la timina, la 5- bromodeoxiuridina (BrdU) se simplificó la detección de los SCE en cromosomas metafásicos (Perry y Wolff, 1974). Desde entonces, el análisis de los SCE pasó a ser considerado como un ensayo rápido, sensible y cuantitativo de daño genético, pudiendo ser realizado con cualquier tipo de célula capaz de replicarse o cuya división pueda ser estimulada.

Con el objetivo de evaluar la respuesta citogenética frente a la exposición a un agente

genotóxico, se viene utilizando este ensayo en estudios in vitro con diferentes cultivos y

líneas celulares, así como en estudios in vivo con animales de laboratorio y en la

biomonitorización de poblaciones humanas (Perry y Wolff, 1974; Latt et al., 1980).

Además, se ha observado que el ensayo ofrece excelentes correlaciones dosis-respuesta

para cientos de compuestos, evaluados en una gran variedad de experimentos in vivo e in

vitro (Tucker et al., 1993).

La principal ventaja del ensayo de SCE es que presenta una alta sensibilidad frente a los agentes que se unen covalentemente al DNA, siendo capaz de detectar efectos a concentraciones a las que otros ensayos citogenéticos no detectan ninguna respuesta genotóxica. Sin embargo, todavía no se conocen con exactitud los mecanismos que

producen los SCE, ni tampoco las consecuencias que pueden ocasionar en la célula

(Natarajan et al., 1994 b). Parece ser que el mecanismo de formación de los SCE es

consecuencia de errores en la replicación del DNA, posiblemente en la propia horquilla de replicación (Painter, 1980) y que los SCE no tienen consecuencias biológicas, ni ejercen ningún efecto letal para las células.

A pesar de las limitaciones mencionadas, el ensayo de SCE que actualmente se considera como un biomarcador de exposición, sigue aplicándose en la evaluación de la capacidad de

los compuestos para inducir daño genético (Mahata et al., 2003; Chen et al., 2005; Ergene

et al., 2007). En algunos casos, puede presentar una sensibilidad mayor que la del ensayo

de aberraciones cromosómicas estructurales en la detección de efectos genotóxicos

(Natarajan et al., 1994 b; Tucker y Preston, 1996).

Cabe resaltar que la frecuencia basal de SCE varía de forma considerable entre individuos

y tipos celulares y suele oscilar entre un rango de 10±5 SCE/célula (Latt et al., 1983). Así,

para evitar que distintos factores externos puedan influir en la frecuencia de SCE, los ensayos deben realizarse en condiciones de cultivo homogéneas (Latt, 1981). Algunas variables como el sexo, el consumo de tabaco y la edad deben ser consideradas como posibles moduladores de la frecuencia basal de SCE. Se asume que estos factores pueden explicar entre un 20-30% de la variabilidad interindividual en la frecuencia basal de SCE, mientras que los factores genéticos serían responsables de aproximadamente un 30% de

esta variabilidad (Bender et al., 1992; Hirsch et al., 1992; Lazutka et al., 1994). Por lo

tanto, en los estudios de biomonitorización en los cuales se utiliza el ensayo de SCE como indicador de daño genético, hay que tener presente tanto las limitaciones del ensayo como el conjunto de variables capaces de influir en la frecuencia de SCE.