Perceptions of Ramsay’s Work

Se han desarrollado un gran número de técnicas para la inmovilización de enzimas en diferentes matrices. Las películas o geles de polímeros y los polímeros conductores se han utilizados para inmovilización de GOD (Xu et al. 2005; Stočes et al. 2011).

En el caso de los envases plásticos, la primera etapa del diseño es la selección de un polímero adecuado para la inmovilización y el uso final del material. En ese sentido, varios tipos de polímeros se han seleccionado como sustratos para la inmovilización de biomoléculas. Para la unión de una biomolécula pueden emplearse tratamientos físicos o químicos.

En el año 2012 Ge et al. reportaron un novedoso material de envase de alimentos a partir de la inmovilización física de GOD en membranas de nanofibras, obtenidas por electrospinning a partir de poli(vinil alcohol) (PVA), quitosano y extracto de te verde (Ge et al. 2012). La actividad antibacteriana de las membranas obtenidas se estudió por el método de recuento de colonias, el

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cual permitió observar actividad antimicrobiana contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Se demostró, entonces, que la GOD inmovilizada en las membranas conduce a una desoxidación eficiente, inhibiendo el crecimiento de material microbiano, en condiciones de bajo contenido de oxígeno, con lo que se prolonga la vida útil de los alimentos. Sin embargo, este desarrollo presenta la desventaja que la GOD ha sido embebida sobre las nanofibras. Es decir que involucra una unión no covalente y por lo tanto, la enzima puede migrar hacia el seno del alimento.

En otro estudio, Zhang & Rocherfort reportaron la microencapsulación (unión física) de la GOD proveniente de Aspergillus niger y Trametes versicolor en polietilenimina (PEI) (Zhang & Rochefort 2011). Los autores observaron que mediante la microencapsulación de GOD se mejora su estabilidad térmica, siendo estable a temperaturas de hasta 60°C, lo cual se debe a la estabilización de su conformación activa. Sin embargo, en el caso de la enzima proveniente de Trametes versicolor se redujo la estabilidad térmica debido al aumento de la coordinación entre PEI y los átomos de cobre en el sitio activo de la enzima. Si bien la actividad enzimática que presentaron las microcapsulas fue menor que la actividad de la enzima libre, puede decirse que el material bioactivo que se fabricó tiene potencial aplicación en el envasado de alimentos. A pesar de lo observado dicho trabajo, al igual que en el anterior, la principal desventaja es la posible migración de la GOD microencapsulada hacia el alimento.

La inmovilización covalente de compuestos bioactivos sobre superficies de polímeros funcionalizados ha tenido un gran crecimiento en la última década, no solo en la industria de alimenticia sino también en la biomédica, textil, microelectrónica, y de bioprocesado. Las técnicas que modifican las propiedades de superficie mediante la introducción de grupos al azar específicos o mediante el recubrimiento de la superficie, son menos útiles en la bioconjugación de la superficie de polímero (Goddard & Hotchkiss 2007). Existen diversas técnicas de modificación de superficie que se han desarrollado para mejorar las propiedades de humectación, adhesión, y de impresión de superficie del polímero mediante la introducción de una variedad de grupos funcionales. Sin embargo, cuando la

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modificación de la superficie se realiza con el fin de obtener un precursor o un grupo de anclaje para la fijación de un compuesto bioactivo, estas técnicas deben adaptarse para introducir un grupo funcional específico.

Dentro de los polímeros que se utilizan en envases se encuentra PP. Este polímero ha sido utilizado en varias aplicaciones de la vida cotidiana debido a sus ventajosas propiedades, como baja densidad, excelentes propiedades térmicas y mecánicas, y buena capacidad de procesamiento a un bajo costo.

Tal como se mencionó en la Parte 1, una técnica muy utilizada en la modificación superficial de PP es la polimerización radicalaria al azar. Se utilizan por ejemplo, tratamientos mediante plasma, injertos (grafting), ya sea fotoinjerto (Galvin & Genzer 2012) o reacción térmica. Vartiainen et al. estudiaron la actividad antimicrobiana de la GOD inmovilizada covalentemente sobre películas biorientadas de PP, previamente activadas por plasma (Vartiainen et al. 2005). Las películas de PP se activaron mediante irradiación con N2-plasma + CO2 y N2-

plasma y tratamiento con NH3 a fin de crear en su superficie grupos carboxílicos.

Posteriormente, se trató la superficie con glutaraldheído y carbodiimina para otorgar los grupos funcionales a fin de inmovilizar covalentemente la GOD. El material desarrollado logró inhibir completamente el crecimiento de Escherichia coli, y parcialmente el crecimiento de Bacillus subtilis. Por lo tanto, el material obtenido por dichos autores puede tener un gran potencial para ser explotado en diversas aplicaciones de envasado antimicrobiano. Sin embargo, mediante técnicas radicalarias al azar es dificultoso el control del largo de la cadena y el porcentaje de injerto.

Como se mencionó en la Parte 1, para tener un mejor control del largo de la cadena injertada y obtener estructuras bien definidas se conoce el uso de polimerizaciones denominadas “vivientes” o radicalarias controladas, dentro de las cuales se destaca la ATRP como una de las metodologías más eficientes de polimerización, que ha sido usada para la modificación superficial controlada y obtención de polímeros tipo cepillo (Matyjaszewski 2012).

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La funcionalidad específica impartida a la superficie inerte debe presentar afinidad por los sitios reactivos del compuesto que se pretende unir covalentemente. Los grupos funcionales comunes en la química de la bioconjugación incluyen epóxidos, tioles, aldehídos, ácidos carboxílicos, hidroxilos, y aminas primarias.

El poli(glicidil metacrilato) (PGMA) es bien conocido como un grupo de anclaje superficial y espaciador de diferentes biomoléculas (Xu et al. 2009; Kawakita et al. 2007; Huang et al. 2008; Arica et al. 2004; W. Eckert et al. 2000; Edmondson & Huck 2004; Sun et al. 2006; Sieval et al. 2000; Stears et al. 2003; Nishiyama et al. 2002; Grano et al. 2004).

Un antecedente bibliográfico interesante involucra la inmovilización covalente de la GOD, utilizando PGMA como sitio de anclaje. El trabajo se llevó a cabo en el año 2005 por Xu et al. En este caso el PGMA se injertó sobre la superficie de Si (111), utilizando la metodología ATRP, es decir, que se logró una estructura de peine bien definida. Posteriormente, se inmovilizó la GOD mediante la apertura del anillo epóxido con la formación de grupos hidroxilo vecinos. PGMA actuó como brazo espaciador, por lo cual GOD posee un alto grado de libertad conformacional y, además, la microestructura generada por ATRP resultó beneficiosa para retener la actividad enzimática. Este material se estudió como un potencial biosensor de glucosa, observando resultados prometedores (Xu et al. 2005). Si bien en este reporte no se inmovilizó GOD para estudiar su actividad antimicrobiana, resultó de interés debido a las ventajas que presentó la enzima al ser unida covalentemente a un polímero funcional (PGMA) injertado por ATRP.

3.1.6.Estudios antimicrobianos

Diversos antecedentes demuestran que los alimentos contienen microorganismos tales como bacterias, mohos, levaduras. Si se tiene en cuenta los tipos de microorganismos asociados a los alimentos vegetales y animales en

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su estado natural, se pueden predecir los tipos generales de microorganismos que se esperan para un alimento en particular, en una etapa posterior de su producción. Se conoce el uso de algunos microorganismos como organismos indicadores ya que pueden emplearse para reflejar la calidad microbiológica de los alimentos en relación con la vida de productos o su seguridad. En general, los indicadores microbianos se emplean con mayor frecuencia para evaluar la inocuidad y saneamiento de los alimentos más que su calidad. Idealmente, un indicador de la seguridad alimentaria debe cumplir con ciertos criterios importantes como por ejemplo: ser fácil y rápidamente detectables, ser fácilmente distinguibles de otros miembros de la biota de alimentos, estar presente cuando el patógeno de preocupación está presente, entre otros. Dentro de los diferentes tipos de bacterias que pueden encontrarse en alimentos, las bacterias S. aureus y E. coli se conocen como indicadores de saneamiento en la manipulación de alimentos (Jay et al. 2005).

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3.2.

Planteo de los objetivos específicos

Teniendo en cuenta los antecedentes expuestos, se plantea como objetivo desarrollar y optimizar una metodología sintética que permita la obtención de un envase activo antimicrobiano, mediante modificación química superficial. Se eligió como sustrato la PP, un material plástico muy usado en envases de alimentos.

Debido a que no existen hasta el momento antecedentes de la aplicación de ATRP para inmovilización de GOD en el diseño de un envase activo, se plantearon los siguientes objetivos específicos: