Chapter 4. US Navy Suface Ship Evaluation
4.4 Performance Comparison of CODLAG System with All-Electric IPS
Medio de Neuronas DRGs / Cocultivos
M1: Minimum Essential Media (MEM, Gibco®-Invitrogen) suplementado con 25 mM de glucosa, 10% de suero bovino fetal (Sigma- Aldrich) inactivado por calor durante 30 min. a 56ºC (FBS H.I.) y 100 ng/mL NGF .
E2F: MEM suplementado con 10 μM fluorodeoxiuridina/uridina (Sigma-Aldrich), 1% de suplemento N2 (Gibco®-Invitrogen), 25 mM Glucosa y 100 ng/mL NGF.
5 días a 4ºC. Los tendones disueltos son centrifugados en condiciones de esterilidad, en tubos de centrifuga (Screw-capped Oak Ridge, Beckman) a 12.000g durante 1 hora (Sorval SS-34 Rotor), se recoge el sobrenadante y este extracto ácido es dializado en tubos de diálisis contra 50 volúmenes de H2O estéril durante 18 horas a 4ºC; transcurrido este tiempo se recupera la solución de colágeno de la bolsa de diálisis, se comprueba su esterilidad y se realizan alicuotas que pueden ser almacenadas por 2 meses a 4ºC.
Para el recubrimiento de las superficies de cultivo previamente tratadas con Poli-L-Lisina, se añade una solución 1:20 en ácido acético. Esta solución se deja evaporar completamente a TA, originando así un recubrimiento grueso de colágeno. Las placas se dejan secar completamente durante, al menos 2 días, antes de ser utilizadas para el establecimiento de cultivos neuronales.
Matrigel
Utilizado como sustrato para el establecimiento del cultivo siguiendo las indicaciones de la casa comercial. Matrigel™ (BD Bioscience), es una preparación de membrana basal solubilizada extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), un tumor rico en proteínas de matriz extracelular (MEC) que también contiene factores de crecimiento procedentes de forma natural del tumor EHS. Se utiliza una dilución 1:40 en HBSS (Hank's Balanced Salt Solution sin rojo fenol, Gibco®- Invitrogen).
Se añade una dilución 1:40 de Matrigel sobre las placas a tratar y se incuba a TA durante 1 hora. Tras retirar el exceso de Matrigel, las placas se lavan tres veces con agua MilliQ estéril y las placas se dejan secar completamente, al menos durante 1 día a TA, pudiéndose almacenar para su uso posterior a 4ºC.
Fibronectina
La fibronectina (Gibco®-Invitrogen) es una glicoproteína dimérica presente en ECM Temperatura Ambiente (TA) y, tras eliminar
el exceso mediante aspiración seguida de tres lavados con agua MilliQ estéril. Para el establecimiento de cultivos de neuronas, las placas se dejan secar de 16 a 24 horas antes de ser tratadas con colágeno.
Colágeno
El Colágeno (Colágeno Tipo I de cola de rata), es un sustrato simple para el establecimiento de cultivos neuronales. Este fue producido en el laboratorio de acuerdo a modificaciones en los métodos descritos por Bornstein y colaboradores [24, 137].
Tras diseccionar las colas a partir de machos adultos mayores de 6 meses de edad, se lavan muy bien con jabón antiséptico y luego son aclaradas con alcohol al 70% y se congelan durante un periodo igual o mayor a 24h a -20ºC en una placa de Petri con papel de filtro; al día siguiente se esterilizan mediante su inmersión en alcohol al 70% durante 20 minutos y se dejan secando en una placa de Petri con papel de filtro en condiciones de esterilidad. Para obtener los tendones, se sostiene la cola a 1-1,5 cm del final (donde se acorta la punta) con dos hemostatos, se fracturan las vértebras sin cortar los tendones (que van desde el músculo pelviano y recorren toda la cola, uniéndose a cada vértebra), una vez fracturada cada vértebra, ésta se empuja lateralmente con la finalidad de separarla del resto de la cola; de este modo los tendones son empujados hacia afuera con ella. Tras liberar el fragmento de vértebra despegado, los tendones se cortan con una tijera fina y se colocan en una placa de cultivo con H2O estéril. Este procedimiento se repite por segmentos cada aproximadamente 1,5 cm. Seguidamente, los tendones así obtenidos se disgregan y al mismo tiempo se remueven los vasos sanguíneos y cualquier otro tipo de tejido conectivo que haya quedado adherido al tendón. Posteriormente, para solubilizar el colágeno, se añaden 150mL de ácido acético al 0,1% por cada gramo de tendón obtenido y se dejan en agitación durante
se establecieron a partir de embriones de ratas Wistar (producidas en el animalario del Instituto de Investigaciones Biomédicas, IIB) en estadio gestacional E16. Los embriones son aislados en condiciones de esterilidad en campana de flujo laminar horizontal y son procesados hasta la exposición de la médula espinal. De la médula aislada se obtienen los ganglios raquídeos, situados por pares a ambos lados de la misma.
Tras su disociación por métodos químicos (45 minutos a 37ºC en Tripsina-EDTA 0,25%, Gibco®-Invitrogen) y mecánicos (mediante varias pasadas por pipeta Pasteur estrechada con calor), son sembradas en placas Falcon pretratadas de 6 pocillos. Para los experimentos de inmunofluorescencia, las células se sembraron sobre cristales cubreobjeto de 25 mm de diámetro (VWR), previamente limpiados con ácido nítrico y tratados con los mismos sustratos. El crecimiento de las células se lleva a cabo en medio M1, en incubador a 37ºC con 5% de CO2 y 95% de humedad. Para la purificación de las neuronas y eliminación de células acompañantes se llevaron a cabo 2-3 ciclos alternos con antimitóticos (E2F) y medio de crecimiento M1. Las células se mantienen entre 15-20 días antes de agregar las SCs, para permitir la formación de una extensa red axonal.
Las SCs se obtienen a partir de nervio ciático de crías de rata Wistar de entre 2 y 5 días de edad siguiendo los métodos descritos en [27]. Tras su disociación química (digestión de 15 minutos con colagenasa A [Roche] a una concentración de 3 mg/ml seguida de otros 15 minutos de digestión en colagenasa más Tripsina-EDTA 0,025% [Gibco]) y posterior trituración mecánica, son pasadas por un colador de 70 µm de diámetro de poro (Falcon) y sembradas en placas de cultivo Falcon (P35 o P60, en función del número de nervios procesados). Las células contaminantes son eliminadas por un ciclo de antimitótico (AraC, 25 µM, Sigma-Aldrich). Las células se recuperan tratando con un mínimo de dos que está formada por dos sub-unidades
unidas entre sí mediante puentes disulfuro situados cerca del extremo carboxilo donde cada unidad esta compuesta por una serie de dominios funcionalmente distintos; un dominio se une al colágeno, otro a la heparina, y otros a receptores específicos de superficie de varios tipos celulares. Forman fibrillas en la superficie de ciertas células pues requieren para su formación proteínas complementarias, especialmente las integrinas que reconocen la fibronectina (α5β1). Es utilizada como sustrato para el establecimiento del cultivo siguiendo las indicaciones de la casa comercial a una concentración de 25μg/mL diluida en MEM. Para tratar las placas de cultivos se utiliza dilución 1:40 de fibronectina y se incuba a TA durante 1 hora. Tras retirar el exceso de sustrato, las placas se lavan dos veces con agua MilliQ estéril y las placas se dejan secar completamente al menos durante 1 día a TA. Una vez que las placas están secas se pueden conservar a 4ºC.
Laminina
Es una glicoproteína que forma parte de la lámina basal y tiene como función el anclaje de células a la lámina basal, pues tiene sitios de unión para integrinas (α6β1). Para su uso como sustrato en el establecimiento del cultivo se siguen las indicaciones de la casa comercial a una concentración de 25μg/mL en HBSS. Se añade una dilución 1:40 de Laminina sobre las placas de cultivo a tratar y se incuba a TA durante 1 hora. Tras retirar el exceso, las placas se lavan dos veces con agua MilliQ estéril y las placas se dejan secar completamente al menos durante 1 día a TA; las placas tratadas con laminina se pueden conservar a 4ºC.