CASE REPORTS GROUP
PHYSICAL EXAMINATION RECORD 1.PHYSICAL STATUS:
3.2.7.1 Relación pH-actividad
El efecto del pH sobre la actividad Rhasa de A. murorum fue estudiado con naringina y con pnp-Ram como sustratos.
Con pnp-Ram como sustrato, el pH óptimo de la actividad Rhasa fue determinado empleando 0,02 µg de proteína purificada del PAGE, dializada a 5ºC frente a BM (pH 6,0), midiendo la actividad enzimática frente a pnp-Ram 5 mM en BM, BT o Buffer Glicina 20 mM en el rango de pH de 4-9. A los efectos de evaluar la liberación de p- nitrofelato en distintas condiciones de pH, este ensayo se realizó midiendo actividad enzimática a tiempo final y deteniendo la reacción con Na2CO3.
Cuando se utilizó naringina como sustrato, la actividad de Rhasa sobre este sustrato fue analizada por HPLC. La reacción se llevó a cabo incubando 900 µl del flavonoide (3,5 mM en BM; BT o Buffer Glicina 20 mM, llevados a los valores de pH a analizar, grado analítico) con 100 µl de enzima (0,04 µg) durante 3 h a 37ºC. Los blancos de sustrato y de muestra fueron realizados utilizando agua bidestilada en reemplazo de sustrato o de enzima respectivamente. Se tomaron muestras de 300 µl al principio y al final del ensayo. La reacción se detuvo añadiendo a la mezcla de reacción un volumen equivalente de solución de acetonitrilo 52 % en ácido fosfórico (60 mM), luego de lo cual la mezcla resultante se filtró a través de un filtro de nylon (0,45 µm de tamaño de poro). La naringina, naringenina, y prunina fueron cuantificadas por HPLC empleando una columna Symmetry C18 (Waters, Milford, MA, USA 3,9 mm x 150 mm.) a temperatura ambiente usando como fase móvil acetonitrilo / agua (0,68 / 0,32, v/v) a un flujo de 1 ml/min y un detector de arreglo de fotodiodos (2996, Waters). Las concentraciones de naringina, prunina y naringenina, fueron identificadas y cuantificadas de acuerdo a sus respectivos patrones.
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3.2.7.2 Estabilidad de las enzimas respecto a pH y temperatura
3.2.7.2.1 Rhasa de A. luteo-albus
La estabilidad térmica de la Rhasa de A. luteo-albus se determinó incubando 350 µl
Tris-HCl (20 mM, pH 9,0) y 50 µl de muestra purificada de PAGE, dializada a 5ºC frente a BM pH 6,0 (0,02 µg) durante 180 min en el rango de 20-70ºC. Al cabo de dicho tiempo la mezcla se colocó en baño de hielo / agua. Previo a la determinación de la actividad residual se preincubó 10 min a 37ºC. La actividad residual se determinó por el método estándar.
3.2.7.2.2 Rhasa de A. murorum
Se estudiaron las condiciones óptimas de reacción, en términos de pH y temperatura, analizando el efecto de ambos factores combinados mediante superficie de respuesta a fin de reducir el número de experimentos sin desechar las interacciones entre dichos parámetros (diseño de Doehlert). Este ensayo se llevó a cabo incubando 350 µl de BT (20 mM, pH 9,0) y 50 µl de muestra purificada de DEAE (dializada a 5ºC frente a BM pH 6,0) durante 180 min en las condiciones que se indican en la Tabla 3.3. Al cabo de dicho tiempo la mezcla se colocó en baño de agua / hielo. A los efectos de evaluar la liberación de p-nitrofelato en distintas condiciones de pH, este ensayo se realizó midiendo actividad enzimática a tiempo final y deteniendo la reacción con Na2CO3.
Tabla 3.3: Condiciones ensayadas para determinar la estabilidad de la Rhasa de A. murorum.
Experimento pH Temperatura A 8,5 48,5 B 11,00 48,5 C 9,75 60 D 7,25 60 E 6,00 48,5 F 7,25 37 G 9,75 37 3.2.7.3 Efecto de cationes
Se determinó la influencia de varios cationes (Ca+2, Cu+2, Fe+3, K+, Mg+2, Mn+2, y Zn+2)
sobre la actividad enzimática utilizando diferentes soluciones de Buffer Tris-HCl (20 mM, pH 9) a cada una de las cuales se les adicionó una de las siguientes sales: CaCl2
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mM, MnCl2 · 4H2O 0,1 mM o ZnSO4 · 7H2O 0,1 mM. En todos los casos, se determinó
la actividad enzimática por medio del procedimiento estándar.
3.2.7.4 Parámetros cinéticos sobre pnp-Ram
Los parámetros cinéticos Vmáx y Km fueron determinados a partir de medidas de velocidad inicial empleando pnp-Rha como sustrato en un rango de concentraciones de 0,2 a 4 mM; a 37ºC, al pH óptimo. El ajuste al modelo clásico de Michaelis-Menten se realizó mediante regresión no lineal empleando el programa Sigma Plot.
3.2.7.5 Hidrólisis de flavonoides
La actividad de Rhasa sobre hesperidina, naringina y quercitrina fue analizada por HPLC. La reacción se llevó a cabo incubando 900 µl de cada flavonoide (3,5 mM en BM, pH 9,5, grado analítico) con 100 µl de enzima (0,04 µg) durante 3 h a 37ºC. Los blancos de sustrato y de muestra fueron realizados utilizando agua bidestilada en reemplazo de sustrato o de enzima respectivamente. Se tomaron muestras de 300 µl al principio y al final del ensayo. La reacción se detuvo añadiendo a la mezcla de reacción un volumen equivalente de solución de acetonitrilo 52 % en ácido fosfórico (60 mM), luego de lo cual la mezcla resultante se filtró a través de un filtro de nylon (0,45 µm de tamaño de poro). La naringina, naringenina, quercitrina, hesperidina y prunina fueron cuantificadas por HPLC empleando una columna Symmetry C18 (Waters, Milford, MA, USA 3,9 mm x 150 mm.) a temperatura ambiente usando como fase móvil acetonitrilo / agua (0,68 / 0,32, v/v) a un flujo de 1 ml/min y un detector de arreglo de fotodiodos (2996, Waters). Las concentraciones de naringina, prunina, naringenina, hesperidina y quercitrina fueron identificadas y cuantificadas de acuerdo a sus respectivos patrones.
3.2.7.5.1 Cromatografía en capa fina (CCF)
Este análisis fue llevado a cabo en láminas de alúmina sílica gel (60 F254) sembrando 5 µl de la mezcla de reacción y los respectivos patrones. Se usó etil acetato / ácido fórmico / ácido acético / agua (10 / 1,1 / 1,1 / 2,7, v/v) como fase móvil. La visualización de los flavonoides fue realizada rociando la lámina con una solución de ácido fosfomolíbdico (3 %), ácido sulfúrico (10 %) en etanol (96 % v/v) seguida de calentamiento a 105ºC durante 5 min.
3.2.7.6 Análisis de huellas peptídicas
Se efectuó una digestión tríptica in situ de las proteínas separadas mediante SDS-
PAGE y coloreadas por la técnica de Coomassie Blue coloidal. Las bandas seleccionadas fueron recortadas con bisturí y almacenadas en tubos Eppendorf para su procesamiento, luego se lavaron con agua MilliQ y acetonitrilo varias veces alternativamente hasta su decoloración y finalmente fueron secadas a presión
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reducida. Para bloquear y reducir el sitio activo se agregaron ditiotreitol y iodoacetamida en NH4HCO3. La digestión se realizó con buffer NH4HCO3 (100mM, pH
7,8) conteniendo tripsina durante 12 h, a 37°C, los productos finales se disolvieron en ácido trifluoroacético (0,1 %, v/v) y se analizaron por MALDI-TOF MS utilizando un Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF (modelo 4800 Analizer, Applied Biosystems, Framingham, EE.UU.).
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