nativa OXIDACIÓN POLIMERIZACIÓN
INTERACCIÓN CON MEMBRANAS CLOROPLÁSTICAS
DEGRADACIÓN Rubi sco
nativa OXIDACIÓN POLIMERIZACIÓN
INTERACCIÓN CON MEMBRANAS CLOROPLÁSTICAS
DEGRADACIÓN
FIGURA i.9. Modelo para la degradación selectiva de la Rubisco (tomado de (49)).
3.5. Papel de los residuos de cisteína en el catabolismo de la Rubisco.
Los residuos de cisteína de la Rubisco son susceptibles de oxidarse por cambios de las condiciones redox en el interior del cloroplasto inducidos por multitud de situaciones de estrés (40, 48, 56, 77). Por otro lado, la oxidación de los grupos tioles del enzima provoca su inactivación y un aumento en su susceptibilidad proteolítica in vitro (55, 147). Debido a que ambos procesos se desencadenan en torno a potenciales redox diferentes, se ha propuesto que los residuos de cisteína implicados en la pérdida de actividad son distintos de los responsables de su conversión en un mejor sustrato para las proteasas (55).
El residuo de cisteína 247, cuya oxidación se ha detectado in vivo en respuesta a tratamientos con Cu2+ (125) o ayuno de nitrógeno (56), no parece tener un efecto sobre la actividad (118, 158), la degradación (118) o la movilización de la Rubisco a la fracción membranosa (125), pero es responsable de la dimerización covalente de dos subunidades grandes. En cambio, se ha demostrado la implicación de la cisteína 172 en la degradación de la Rubisco in vivo. Así, cuando este residuo se reemplaza por serina en C. reinhardtii, la degradación de la Rubisco se retrasa respecto al control silvestre al someter las células a estrés oxidativo u osmótico (133) y de forma similar, cuando se sustituye por Ala en Synechocistis sp. la pérdida de Rubisco inducida por una deficiencia de nitrato en el medio, se reduce considerablemente respecto a los cultivos control (118).
El retraso en la degradación de la Rubisco del mutante en la cisteína 172 de C. reinhardtii se correlaciona con una disminución de su susceptibilización proteolítica inducida por oxidación in vitro. Sin embargo, la mutación no afecta a la inactivación redox del enzima, y tampoco impide la transición de la Rubisco hacia su forma sensible al ataque por proteasas cuando las condiciones son lo suficientemente oxidantes (133). Esta observación reafirma la idea de que diversos residuos de cisteína contribuyen a través de distintas vías a los procesos de inactivación y proteolisis promovidos por un aumento en las condiciones oxidantes del medio, como el que se da durante la senescencia natural o inducida por estrés. Debido a que dichas respuestas están muy extendidas entre diferentes especies, cabe esperar que esta regulación sea ejercida por residuos de cisteína conservados. El estudio del papel concreto de cada una de
estas cisteínas en los diferentes procesos asociados con el catabolismo de la Rubisco ayudaría a comprender el modo en que la oxidación de estos residuos moldea el enzima hacia una forma catabolizable, y a descifrar alguna de los elementos clave de este mecanismo central en la vida de los organismos fotosintéticos.
OBJETIVOS
En este trabajo se ha pretendido profundizar en el conocimiento de los mecanismos que regulan la actividad y la disponibilidad proteolítica de la Rubisco a través del estado de oxidación de residuos de cisteína del propio enzima. Dentro de este tema se plantearon los siguientes objetivos concretos:
1) Estudio del patrón diferencial de proteolisis de Rubisco reducida y oxidada. Los antecedentes indican que la modificación oxidativa de la Rubisco es una de las piezas clave en el mecanismo que dispara las rutas catabólicas del enzima. Además, la oxidación in vitro del enzima (y más concretamente, de sus cisteínas) lo convierte en un sustrato más accesible a la acción de proteasas exógenas (147). Esta variación de la susceptibilidad proteolítica de la Rubisco se debe probablemente a cambios conformacionales de la proteína inducidos por la oxidación. En la actualidad, no se posee la información estructural necesaria para determinar la naturaleza de estos cambios, ya que todos los datos cristalográficos de las Rubiscos resueltas hasta ahora corresponden al enzima reducido. Por ello, se decidió realizar un estudio detallado de las modificaciones del patrón de proteolisis de la Rubisco inducidas por la oxidación específica de cisteínas. Esta investigación pretendía detectar cambios conformacionales en la Rubisco oxidada utilizando proteasas de baja especificidad como sondas estructurales, dilucidar detalles del mecanismo de degradación de la proteína in vitro, y comparar los resultados con los datos bibliográficos de fragmentación proteolítica in vivo con objeto de evaluar la posible implicación de este mecanismo.
2) Obtención de mutantes de Rubisco por sustitución de residuos conservados de cisteína.
Dada la similitud de los efectos de la oxidación de cisteínas en las Rubiscos de especies filogenéticamente alejadas, los residuos de cisteína conservados parecen firmes candidatos para mediar la regulación redox del enzima. Con objeto de investigar la función concreta de cada uno de estos residuos en la modulación redox de las propiedades de la Rubisco, tanto in vitro como in vivo, nuestro grupo de investigación se propuso llevar a cabo la mutagénesis dirigida de cada una de las cisteínas conservadas y el estudio de los fenotipos mutantes. La sustitución de los residuos de cisteína por serina permite eliminar la actividad redox del residuo mutado mediante el cambio de un único átomo en la molécula (S por O).
Objetivos
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del resto de cisteínas conservadas de la Rubisco de C. reinhardtii. Éstas son las Cys 84, 247, 284 y 459 de la subunidad grande y las Cys 41 y 83 de la subunidad pequeña. Además, se planeó también la obtención del mutante de la Cys 449 de la subunidad grande, ya que este residuo (algo menos conservado) se halla muy cerca de la Cys 459 y podría interaccionar con ella.
3) Estudio del papel del par Cys 449-Cys459 en la modulación redox de la Rubisco.
De entre los mutantes programados en el capítulo anterior, se escogieron para una caraterización más detallada los correspondientes a los residuos de cisteína 449 y 459.
El residuo de cisteína 459 de la subunidad grande de Rubisco presenta un alto grado de conservación entre las secuencias de plantas superiores, algas verdes y cianobacterias. Además, en C. reinhardtii este residuo se encuentra a una distancia de la cisteína 449 (con un grado de conservación importante) compatible con la formación de un puente disulfuro, que podría tener algún papel estructural o de regulación. Con objeto de poder evaluar una posible redundancia funcional de estos residuos, se incluyó también la obtención y caracterización del doble mutante C449S/C459S.
Para abordar estos objetivos, se escogió como sistema experimental el alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii, considerada como organismo modelo para el estudio del cloroplasto, ya que es posible la transformación eficiente tanto del genoma nuclear como del cloroplástico, y se dispone de mutantes de Rubisco no fotosintéticos que pueden ser utilizados como cepas receptoras en la transformación. Entre ellos, se incluye el mutante T-60 que, en la actualidad, es el único organismo que permite la expresión de mutaciones de la subunidad pequeña sin interferencia de la proteína silvestre.
Los resultados obtenidos y su correspondiente discusión se han estructurado en tres capítulos, que se ajustan a cada uno de los objetivos propuestos.