Plaque psoriasis

1.2.1. Análisis de secuencias genómicas repetitivas tipo LINE-1 (“Long Interspersed Nuclear Element-1”)

En el estudio en humanos la determinación de la metilación global del genoma se realizó mediante el análisis de secuencias genómicas repetitivas tipo retrotransposones llamados LINE-1. Dichas secuencias son ricas en dinucleótidos CpG susceptibles a metilación por lo que su nivel de metilación es considerado una buena estimación de la metilación global del genoma ([7813]). Para ello, se utilizó el kit “PyroMark® Q96 CpG LINE-1” (Qiagen) con el que se amplificó la secuencia de interés, para posteriormente determinar por pirosecuenciación la metilación de cuatro dinucleótidos CpG situados entre las posiciones 331 y 305 de dichos elementos LINE-1 (GenBank accession number X58075).

Todos los procesos de amplificación por PCR se realizaron en una cabina de flujo laminar vertical sin recirculación (Euro Aire, mod. FLV 60) y siguiendo normas estrictas para evitar la contaminación. Se amplificó un fragmento de secuencia LINE-1 de 146 Kb, mediante el uso de dos cebadores ó “primers” (“forward” y “reverse”) específicos para dicha secuencia, uno de ellos biotinilado (“reverse”). La amplificación se realizó en un volumen final de 25 µL utilizando 25 ng de ADN modificado, 0,4 mM dNTPs (Roche), 2 mM MgSO4 (Life

Technologies), 0,2 µM de cada cebador, 1X High Fidelity PCR Buffer (Life Technologies), y 1U de Platinum® Taq High Fidelity (Life Technologies). En todas las rondas de amplificación,

se añadieron controles negativos de la PCR que contenían H2O “RNasa-free” en vez de ADN

modificado y el resto de componentes de la reacción en las cantidades descritas. Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo en el termociclador C1000™ (BioRad Laboratories) y, para ello, se procedió a una etapa de activación de la Platinum® Taq a 95ºC

hibridación (50ºC durante 30 segundos) y elongación (72ºC durante 30 segundos), y una extensión final a 72ºC durante 5 minutos.

La especificidad de la amplificación se comprobó por electroforesis en geles del 2% de agarosa. Se utilizó DNA Molecular Weight Marker V (8-587 bp) (Roche) como marcador de peso molecular. Los geles y las muestras se prepararon según Sambrook et al. ([2648]) y se utilizó TAE 1x (40 mM Tris-Acetato, 1 mM EDTA pH 8,0) como tampón de electroforesis. Se prepararon minigeles de 7 x 10 cm y un grosor de 2-3mm y se aplicó un voltaje de 80 V durante 30 minutos. Un volumen equivalente a 3 µl del producto de la amplificación fue diluido en agua bidestilada estéril y se le añadió 1/6 parte del volumen de tampón de carga de ADN (30% glicerol, 0,25% azul de bromofenol). La visualización de las secuencias de ADN amplificadas se consiguió por tinción con bromuro de etidio y las imágenes fueron captadas por el sistema Gel Doc 2000 (BioRad Laboratories), tal y como ya ha sido descrito (apartado 1.1.1).

Una vez comprobada la amplificación, se procedió a la determinación del estado de metilación de las cuatro posiciones CpG del fragmento amplificado mediante pirosecuenciación, tecnología basada en la monitorización a tiempo real de la síntesis de ADN mediante la detección de luminiscencia. Dicha determinación se realizó en el “Centre de Recerca en Agrigenòmica” (CRAG) de la Universidad Autónoma de Barcelona, utilizando el pirosecuenciador PSQ HS 96 (Biotage Inc.). Para ello, se realizó la purificación de los productos de la amplificación inmovilizando los fragmentos amplificados (marcados con biotina) sobre microesferas de sefarosa recubiertas con estreptavidina. Seguidamente, el ADN amplificado fue desnaturalizado obteniendo secuencias monocatenarias que se hibridaron con el cebador de secuenciación. A continuación, se procedió a la dispensación de nucleótidos según el orden establecido para la secuencia a analizar. En el estudio en humanos la secuencia a analizar fue TTYGTGGTGYGTYGTTTTTTAAGTYGGTTT y el orden de dispensación de los nucleótidos fue ATCAGTGTGTCAGTCAGTTAGTCTG. La detección de la secuencia se basa en que con cada incorporación de nucleótidos por parte de la ADN polimerasa, se libera pirofosfato (PPi) en una cantidad equimolar a la cantidad de nucleótido incorporado. La ATP sulfurilasa es la responsable de convertir el PPi en ATP en presencia de adenosina 5' fosfosulfato, provocando la conversión de la luciferina en oxiluciferina mediada por el enzima luciferasa, generando luz visible en cantidades proporcionales a la cantidad de ATP. Así, la luz emitida se visualiza como picos en el pirograma obtenido. De este modo, cada señal luminosa es proporcional al número de nucleótidos incorporados.

A partir del pirograma resultante se calculó el porcentaje de la cantidad de citosina (C) relativa a la suma de cantidades de citosina y timina (T) de cada posición CpG. El promedio de las cantidades relativas de C en las cuatro posiciones analizadas se utilizó como nivel de metilación de LINE-1 y, por tanto, como nivel de metilación genómica.

En el estudio en el modelo experimental, la estandarización para analizar la metilación de secuencias repetitivas LINE-1 del genoma de rata no fue satisfactoria, dado que se detectaron amplificaciones inespecíficas en la etapa de la pirosecuenciación. Por ese motivo, la determinación de la metilación global se realizó mediante el ensayo “LUMA” (descrito en el apartado 1.2.2).

1.2.2. Análisis de la metilación global por LUMA (“LUminometric Methylation Assay”)

En el estudio en el modelo experimental, se determinó la metilación global del genoma mediante el ensayo “LUMA”, tal y como describió Karimi M. et al. ([8422]) con modificaciones ([8438]). Este ensayo consiste en la digestión del ADN genómico con endonucleasas de restricción sensibles ó insensibles a metilación, seguido de una fase final de extensión bioluminométrica capaz de cuantificar el grado de escisión por restricción mediante pirosecuenciación. Para ello, las muestras de ADN genómico son sometidas a digestión por la endonucleasa HpaII (sensible a metilación) y su isoesquizómero MspI (insensible a metilación) en reacciones en paralelo. Ambos enzimas reconocen la secuencia 5’-C^CGG-3’. Sin embargo,

HpaII no digiere la diana de restricción cuando la citosina presente en el dinucleótido CpG

está metilada, mientras que MspI digiere la diana independientemente del estado de metilación. Como factor de normalización de la cantidad de ADN sometido a digestión, se incluyó en ambas reacciones el enzima EcoRI cuya diana de restricción son secuencias 5'- G^AATTC-3’. De este modo, se sometieron a digestiones paralelas de HpaII+EcoRI y

MspI+EcoRI, 500 ng de ADN genómico de tejido mamario ó tejido tumoral con 5 unidades

del enzima correspondiente (New England Biolabs) y 1X de tampón de restricción que contiene un suplemento de S-adenosil-L-metionina (SAM) (New England Biolabs), en un volumen final de 20 µl. Las reacciones de digestión se realizaron por duplicado en placas de PCR de 96 pocillos (BioRad Laboratories) y se incluyeron controles negativos de ambas digestiones, que contenían H2O “RNasa-free” en vez de ADN genómico y el resto de

un incubador (Memmert) durante 4 horas. Posteriormente, las muestras digeridas fueron analizadas en el “Centre de Recerca en Agrigenòmica” (CRAG) de la Universidad Autónoma de Barcelona, utilizando el pirosecuenciador PSQ HS 96. La digestión por las endonucleasas

HpaII y MspI provocan extremos 5’-CG, mientras que la digestión por EcoRI produce

extremos 5’-AATT. Estos extremos son elongados mediante la dispensación secuencial de nucleótidos y la acción de la ADN polimerasa. En este estudio, el orden de dispensación fue GTGTCACATGTGTG. Se obtuvieron pirogramas de cada una de las reacciones de digestión (HpaII+EcoRI y MspI+EcoRI), en los que el valor del pico de la posición 10 correspondió a la incorporación de G y, por tanto, fue proporcional a la digestión enzimática de HpaII ó MspI, y el valor del pico de la posición 9 correspondió a la incorporación de T en la secuencia de síntesis, siendo proporcional a la digestión mediada por EcoRI (Figura 16).

HpaII + EcoRI MspI + EcoRI 9 10 9 10 HpaII + EcoRI MspI + EcoRI 9 10 9 10

Figura 16. Pirograma representativo del ensayo “LUMA”. Pirogramas

obtenidos para cada una de las reacciones de digestión (HpaII+EcoRI y MspI+EcoRI) realizadas para una determinada muestra. En la base de cada pirograma se indican las posiciones 9 (incorporación de T) y 10 (incorporación de G).

De esta forma, se pudo determinar el porcentaje de metilación global para cada muestra aplicando la fórmula siguiente: