THE POWER OF ONE-WAY ANOVA

La estructura estudiada fue la cavidad presente en el eje de simetr´ıa qu´ıntuple. Como se menciono anteriormente, esta cavidad est´a compuesta por los seis anillos de glutamina

1128, valina 1166 y treonina 1167 pertenecientes a VP1, y glutamina 3014, valina 3012 y treonina 3010 pertenecientes a VP3 (Figura 3.4).

Una vez armados los dos sistemas descriptos en la secci´on de protocolo con aguas SPC, TrV Full WT y TrV WT, se procedi´o a su an´alisis. El primer paso fue la comparaci´on

de ambas estructuras para ver si los resultados de la segunda simulaci´on son confiables. Para ello se estudi´o el RMSD, el radio de giro y la din´amica de ambas estructuras,

particularmente en los bordes del pent´amero aislado y en el eje qu´ıntuple de ambas simulaciones.

Observando los gr´aficos 3.5a y 3.5b se puede observar que ambas estructuras llegan a converger en valores no muy lejanos de la estructura de referencia. Si bien la estructura

Figura 3.4: Amino´acidos que forman el poro de TrV. (Izquierda) Pent´on de TrV visto de lado. Las prote´ınas est´an coloreadas azul para VP1, verde para VP2 y rojo para VP3. (Derecha) Amino´acidos que forman el poro presente en el eje qu´ıntuple. Los amino´acidos est´an coloreados en verde los polares y en naranja los no-polares.

de TrV WT llega a valores levemente mayores, estos valores todav´ıa son aceptables. Lo

mismo se puede observar en las figuras 3.5c y 3.5d donde se observan los radios de giro de ambas estructuras. Ambos valores permanecen constantes en la mayor´ıa de la

simulaci´on y nos demuestra que la forma tridimensional de ambas estructuras no cambi´o sustancialmente. Es decir, la c´apside no se desensambl´o y el pent´amero mantuvo su

estructura cuaternaria.

Por otra lado, se estudi´o las din´amicas de ambas simulaciones para ver que no ocurriera

ning´un cambio sustancial en la estructura y finalmente se estudi´o el comportamiento del poro presente en el eje qu´ıntuple. En el caso de la c´apside completa se analizaron los 12

poros y en el caso del pent´amero el ´unico presente.

Debido a que se observ´o el mismo comportamiento en ambas simulaciones y a que

la simulaci´on del pent´amero aislado resulta un sistema de un n´umero considerablemente menor de part´ıculas (∼170.000 contra∼1.300.000 ´atomos), se decidi´o continuar todos los estudios con esta simulaci´on ya que permite aumentar considerablemente los tiempos de simulaci´on.

Adem´as, a partir de lo observado en la figura 3.5a, se consider´o que el sistema conver- gi´o, es decir lleg´o a una estructura estable, a partir de los 10 ns. Teniendo esto en cuenta,

se realizar´an todos los an´alisis siguientes utilizando los 90 ns finales de la simulaci´on TrV WT.

De esta simulaci´on, se puede observar que el poro presente en el eje qu´ıntuple presenta una zona deshidratada, donde no penetra ninguna mol´ecula de agua. Esto se observa

(a) (b)

(c) (d)

Figura 3.5: RMSD del backbone y Radio de giro de TrV: (a) y (c) pent´amero y (b) y (d) C´apside completa. En los gr´aficos de RMSD se ve la convergencia de las estructuras. En conjunto con el radio de giro se puede ver que las estructuras permanecen estables a lo largo de la simulaci´on sin una variaci´on considerable de su estructura tridimensional.

claramente en la figura 3.6C, donde se puede ver una vista lateral del poro del eje qu´ıntuple de TrV. Como se aprecia en la figura, la regi´on deshidratada coincide con la posici´on

de la Valina 3012 que es un amino´acido con car´acter no-polar o hidrof´obico. Esto se compar´o con el mapa de densidad promedio de mol´eculas de agua, calculado con el

g densmap utilizando los ´ultimos 90 ns. En el mismo se puede observar (Figura 3.6B) que esta ausencia de mol´eculas de agua no es un evento fortuito de un ´unico instante en la

simulaci´on sino que es un fen´omeno que ocurre a lo largo de toda la simulaci´on.

A su vez, se puede ver (Figura 3.6A) que esta regi´on hidrof´obica coincide con la regi´on

de menor radio del poro. Utilizando el programa HOLE se puede observar que el radio del poro en la regi´on m´as angosta puede alcanzar valores mayores a 1.4 ˚A. Teniendo en

cuenta que el radio de Van der Waals de una mol´ecula de agua es de∼1.4 ˚A, la ausencia de mol´eculas de agua en esta regi´on no es necesariamente por un impedimento est´erico

Figura 3.6: Estructura del poro presente en el eje qu´ıntuple de TrV. (A) Radio del poro representado en una superficie, donde la regi´on verde corresponde a la de menor radio. (B) Mapa de densidad de mol´eculas de agua en el poro en funci´on del radio del poro y la posici´on vertical. (C) Vista lateral del poro de TrV en la simulaci´on del pent´amero aislado, en verde se muestran los amino´acidos con car´acter polar y en naranja los de car´acter no-polar.

postula la existencia de un mecanismo de puerta hidrof´obica que regule la apertura y

cierre del poro. Este tipo de mecanismos es com´unmente estudiado en canales i´onicos de prote´ınas de membrana, pero nunca ha sido observado en c´apsides virales.

Para confirmar esta hip´otesis se realizaron varias simulaciones donde las valinas 3012 fueron mutadas por otros amino´acidos (Glicina, Serina, Treonina y Asparagina). Se eligi´o

a la glicina por su reducida cadena lateral, el fin era observar si aumentando el espacio disponible para las mol´eculas de agua estas entrar´ıan. Por otro lado, las mutaciones

con serina, treonina y asparagina fueron realizadas para ver si la imposibilidad de que las mol´eculas de agua penetraran en el sistema era por motivos est´ericos o debido a la

caracter´ıstica no-polar de la valina. Particularmente, la serina y la treonina poseen una cadena lateral de similar longitud con la de la valina, mientras que la asparagina posee

Tanto la mutaci´on de treonina como la asparagina, no presentaron hidrataci´on com-

pleta de la cavidad. Sin embargo, una minuciosa inspecci´on de la simulaci´on y de la estructura formada por estos amino´acidos muestra que el poro siempre se encuentra ce-

rrado est´ericamente por las cadenas laterales de estos amino´acidos. Por otro lado, la mutaci´on por glicina presenta una hidrataci´on de sus alrededores. No obstante, la pre-

sencia de las glicinas provocan un cambio conformacional en el poro generando un cierre

del mismo en la regi´on ocupada por VP1. Esto indicar´ıa que la presencia de las valinas tiene una implicancia estructural en el poro adem´as de regular su apertura.

Por ´ultimo, la mutaci´on por serina, cuya cadena lateral es similar en longitud a la de la valina pero posee caracter´ısticas polares, present´o una completa hidrataci´on del

poro sin alterar la estructura del pent´amero (Figura 3.7). En este caso los mapas de densidad fueron creados con los ´ultimos 80 ns de simulaci´on, ya que el RMSD de esta

simulaci´on muestra convergencia a partir de los 20 ns y adem´as este instante coincide con la hidrataci´on del poro.

Figura 3.7: Estructura del poro presente en el eje qu´ıntuple de TrV al mutar la valina 3012 por una serina. (A) Mapa de densidad de mol´eculas de agua en el poro en funci´on del radio del poro y la posici´on vertical. (B) Vista lateral del poro de TrV mutado, en verde se muestran los amino´acidos con car´acter polar y en naranja los de car´acter no-polar.

Todos los resultados mencionados anteriormente para el pent´amero aislado con aguas

SPC fueron repetidos cambiando el modelo de aguas al SPCE. Todas las simulaciones del pent´amero y sus mutaciones muestran el mismo comportamiento observado para las

simulaciones donde se utiliz´o el modelo de aguas SPC.

Basado en estos resultados, se propone que el eje qu´ıntuple de TrV presenta un poro

capaz de comunicar el medio exterior de la c´apside con su interior y adem´as posee una

puerta hidrof´obica situada a la altura de las valinas 3012. Esta caracter´ıstica no ha sido observada en c´apsides virales pero s´ı ha sido estudiada en canales i´onicos de membrana

y otros sistemas no biol´ogicos [83, 44, 84, 85].