Las levaduras combinan la facilidad de su manipulación genética y las características de crecimiento de los procariotas con los mecanismos de modificación postraduccional de los eucariotas. Por ello, diversas especies de levaduras se consideran potencialmente útiles como sistemas de producción heteróloga de proteínas y péptidos de interés biotecnológico (Cregg et al., 1993).
La primera levadura descrita como sistema de producción heteróloga de proteínas y péptidos es Sc.
cerevisiae (Cregg et al., 1993), ya que, al igual que E. coli, Sc. cerevisiae es uno de los
mayoría de las cepas como microorganismos seguros para las personas favorece su elección como hospedador para la producción heteróloga de proteínas y péptidos de interés. Además, en los últimos años se han desarrollado plásmidos y vectores de integración cromosómica y diversos promotores (por ej.: alcohol deshidrogenasa y Cup-1) y SPs (por ej.: MFα1s) que permiten la expresión y secreción de
proteínas, intrínsecas y extrínsecas a la levadura, al medio extracelular (Brake et al., 1984; Brake, 1989, 1990; Bardazzi y Casalone, 2004; Schuller y Casal, 2005; Cebollero et al., 2007). A este respecto, en un trabajo reciente Schuster et al. (2000) han expresado y/o secretado 20 proteínas en Sc.
cerevisiae empleando dos plásmidos diferentes: (i) YEp-Flag-1, que permite la expresión y secreción
de proteínas bajo el control del promotor de la alcohol deshidrogenasa y de MFα1s y (ii) Yep-B, que
permite la expresión de proteínas bajo el control del promotor Cup-1. Asimismo, Parolin et al. (2005) han expresado cinco antígenos del virus de la hepatitis C en tres cepas de Sc. cerevisiae empleando dos vectores diferentes bajo el control del promotor TPI (del inglés Triose Phosphate Isomerase): (i) vector de integración pYX012 y (ii) vector de expresión pYX212. A pesar de estos resultados, la utilización de Sc. cerevisiae como hospedador heterólogo no siempre se considera ideal para la producción de proteínas recombinantes. En este contexto, el empleo de levaduras metilotróficas supone una alternativa frente a los inconvenientes de Sc. cerevisiae, derivados de: (i) su bajo nivel de producción, (ii) su inestabilidad, (iii) su alto grado de glucosilación y/o (iv) su difícil adaptación a ensayos de tipo industrial (Hollenberg y Gellissen, 1997).
De entre las levaduras metilotróficas, Pc. pastoris es el microorganismo más utilizado como modelo para el desarrollo de sistemas de producción heteróloga de proteínas. Este sistema de producción heteróloga ha ganado popularidad en los últimos años debido a una serie de factores, entre los que destacan: (i) la simplicidad de las técnicas para su manipulación genética, (ii) la habilidad para producir, intracelularmente o extracelularmente, grandes cantidades de proteína recombinante, (iii) la capacidad para desarrollar modificaciones postraduccionales en las proteínas recombinantes y (iv) la disponibilidad de sistemas de expresión heteróloga comerciales (Cereghino y Cregg, 1999, 2000; Cregg et al., 2000; Ilgen et al., 2005; Han et al., 2006; Li et al., 2007). Asimismo, existen numerosos plásmidos que permiten la expresión intracelular o extracelular de proteínas en Pc. pastoris, entre los que destacan pPICZα (A, B, C,), pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5 y pPIC9. Estos plásmidos contienen el gen AOX1 que les permite integrarse, previa linearización, en el cromosoma de esta levadura. Además, la mayoría de estos plásmidos están bajo el control del promotor de la alcohol oxidasa, no obstante, algunos promotores permiten obtener, en determinadas circunstancias, mejores resultados, entre los que destacan: (i) promotor constitutivo GAP (del inglés Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase); (ii) promotor FLD1, inducible por metanol o metilamina; (iii) promotor PEX8, inducible por metanol y (iv) promotor constitutivo YPT1. Asimismo, estos plásmidos emplean diversos SPs (por ej.: MFα1s,
PHO1, SUC2 y PHA-E) para la expresión y secreción de las proteínas al medio extracelular (Cereghino y Cregg, 1999, 2000; Cereghino et al., 2002; Carresi et al., 2006; Han et al., 2006; Muraki, 2006; Li et
al., 2007). Por todo ello, de forma general, la utilización de Pc. pastoris como hospedador heterólogo
permite obtener buenos resultados de producción de proteínas recombinantes y la adaptabilidad de los ensayos de laboratorio a situaciones de tipo industrial (Cregg et al., 1993; Cereghino y Cregg, 2000).
En lo que respecta a la producción heteróloga de bacteriocinas en levaduras (Tabla II.16), Schoeman et al. (1999) han descrito la producción heteróloga de PedPA-1 de P. acidilactici PAC1.0 por Sc. cerevisiae. Para ello, estos investigadores utilizaron un vector de expresión (YEp352) en el que PedPA-1 está fusionada a MFα1s de Sc. cerevisiae y su expresión bajo el control del promotor de la
alcohol deshidrogenasa. La transformación de Sc. cerevisiae con el plásmido recombinante permitió la producción de PedPA-1 biológicamente activa. No obstante, la actividad antimicrobiana de PedPA-1 en los sobrenadantes de los cultivos de las levaduras recombinantes fue muy reducida y sólo se detectó en los sobrenadantes concentrados, lo que se atribuyó a que la bacteriocina se mantenía asociada a la membrana o a la pared celular de las células productoras. Asimismo, la ausencia de técnicas analíticas fiables para la detección y cuantificación de PedPA-1 en los sobrenadantes de los cultivos productores no permitió determinar la relación entre PedPA-1 producida y su actividad biológica, probablemente disminuida por una posible glucosilación de su molécula, la actividad de enzimas proteolíticas, la agregación entre sí o a otras moléculas u otras razones bioquímicas o biofísicas. Recientemente, van Reenen et al. (2003) han expresado Plt423 de Lb. plantarum 423 en Sc. cerevisiae, observándose las mismas limitaciones que las encontradas por Schoeman et al. (1999).
Tabla II.16. Bacteriocinas de bacterias lácticas producidas heterólogamente por levaduras
Actividad antimicrobianaa
Bacteriocina Clase Microorganismo productor Hospedador heterólogo
Medio sólido
Medio líquido
Referencia
Pediocina PA-1 IIa P. acidilactici PAC1.0 Sc. cerevisiae + +b Schoeman et al. (1999)
Plantaricina 423 IIa Lb. plantarum 423 Sc. cerevisiae + +b Van Reenen et al. (2003)
Enterocina P IIa E. faecium P13 Pc. pastoris + + Gutiérrez et al. (2005a)
Pediocina PA-1 IIa P. acidilactici PAC1.0 Pc. pastoris N.D. - Beaulieu et al. (2005)
Hiracina JM79 IIa E. hirae DCH5 Pc. pastoris + + Sánchez et al. (2008)
aLos símbolos + y – representan presencia y ausencia de actividad antimicrobiana, respectivamente. N.D., no determinado. bLa actividad antimicrobiana únicamente se detectó empleando un sobrenadante concentrado del cultivo correspondiente.
Por otra parte, los trabajos realizados para la producción heteróloga de bacteriocinas en Pc.
pastoris han mostrado resultados contradictorios (Tabla II.16) (Beaulieu et al., 2005; Gutiérrez et al.,
2005a; Sánchez et al., 2008). Así pues, Gutiérrez et al. (2005a) han descrito la producción heteróloga de EntP, producida por E. faecium P13, en Pc. pastoris mediante la clonación de la región génica que codifica EntP madura en el plásmido pPICZαA, en el mismo marco de lectura que MFα1s de Sc.
cerevisiae, pero sin los espaciadores Glu-Ala adyacentes al lugar de procesamiento de la endopeptidasa
Kex2, y bajo el control del promotor inducible del enzima de la alcohol oxidasa. La transformación de
Pc. pastoris con el plásmido recombinante se tradujo en la obtención de una levadura recombinante
que mostró una actividad biológica mayor a la obtenida por E. faecium P13. Para la detección y cuantificación de la producción de EntP se emplearon anticuerpos policlonales de especificidad predeterminada frente a EntP (Gutiérrez et al., 2004), observándose que la producción de la levadura recombinante era 2,6 y 3,7 veces mayor que la producida por E. faecium P13 (Gutiérrez et al., 2005a). Por otra parte, Sánchez et al. (2008) han expresado la hiracina JM79 de E. hirae DCH5 en Pc. pastoris empleando el mismo protocolo descrito por Gutiérrez et al. (2005a). Para la detección y cuantificación de la producción de la hiracina JM79 se emplearon anticuerpos de especificidad predeterminada frente a esta bacteriocina, observándose que la producción de la levadura recombinante era 2 y 5 veces mayor
que la producida por E. hirae DCH5. A pesar de ello, la actividad antimicrobiana de estas levaduras recombinantes sólo representó un 33 y un 76% de la máxima actividad antimicrobiana de la cepa salvaje. Finalmente, Beaulieu et al. (2005) han expresado PedPA-1 de P. acidilactici PAC1.0 en Pc.
pastoris. El empleo de anticuerpos de especificidad predeterminada frente a PedPA-1 permitió
determinar que la producción de esta bacteriocina por la levadura recombinante era 12 veces mayor que la producida por la cepa salvaje, no obstante, no se detectó su actividad antimicrobiana en los sobrenadantes de los cultivos productores, especulándose con la posibilidad de que PedPA-1 permaneciera asociada a material colágeno producido por la levadura, lo que interferiría con su actividad biológica (Beaulieu et al., 2005).
L50B), P y Q, frente a bacterias lácticas alterantes de la
cerveza en medio de cultivo, mosto cervecero (con y sin
lúpulo) y cervezas con y sin alcohol
An
CAPÍTULO III/CHAPTER III
Actividad antimicrobiana de Enterococcus faecium L50,
una cepa productora de las enterocinas L50 (L50A y
timicrobial activity of Enterococcus faecium L50, a strain
producing enterocins L50 (L50A and L50B), P and Q,
against beer-spoilage lactic acid bacteria in broth, wort
(hopped and unhopped), and alcoholic and non-alcoholic
lager beers
(Manuscrito aceptado para su publicación en International Journal of Food Microbiology. Ref. Nº FOOD-D-07-00582)