Se tabularán las medidas de densidad celular en los cultivos de ensayo y en los controles, junto con las concentraciones de la sustancia de ensayo y los tiempos a los que se realizan las determinaciones. Se hará una gráfica del valor medio de la densidad celular para cada concentración de sustancia de ensayo, así como para los testigos, en función del tiempo (0-72 horas), a fin de conseguir curvas de crecimiento.
Para determinar la relación concentración/efecto, pueden utilizarse los dos enfoques siguientes. Algunas sustancias pueden estimular el crecimiento a bajas concentraciones. Sólo se tendrán en cuenta los datos que indiquen una inhibición entre 0 y 100%.
2.1. Comparación de las áreas bajo las curvas de crecimiento
El área entre las curvas de crecimiento y la línea horizontal N = N0 puede calcularse de acuerdo con la fórmula: A = ([N1 − N0] ; 2) ? t1 + ([N1 + N2 2N0] ; 2) X [t2 − t1] + ... + ([Nn−-1+ Nn − 2N0]) ; 2 ? (tn − tn−1)
en la que: A = área,
N0 = número de células/ml en el momento t0(comienzo del ensayo), N1 = número medido de células/ml a t1,
Nn = número medido de células/ml a tn,
t1 = tiempo en que se realiza la primera medida tras el comienzo del ensayo, tn = tiempo en que se realiza la medida n tras el comienzo del ensayo, n = n = número de medidas hechas tras el comienzo del ensayo.
El porcentaje de inhibición del crecimiento celular para cada concentración de sustancia de ensayo (IA) se calculará de acuerdo con la fórmula:
IA= ([Ac − At]/Ac) ? 100 donde:
Ac = área entre la curva de crecimiento del testigo y la línea horizontal N = N0.
At = área entre la curva de crecimiento a la concentración t y la línea horizontal N = N0.
Los valores IAse representarán en una gráfica en papel semilogarítmico o en papel probit semilogarítmico en función de las concentraciones correspondientes. Si la gráfica se hace en papel probit, se unirán los puntos con una línea recta, bien de forma aproximada o mediante una regresión por ordenador.
Para expresar este valor de forma inequívoca en relación a este método de cálculo, se propone utilizar el símbolo C50Eb. Es esencial que C50Eb vaya acompañada del período adecuado de exposición, por ejemplo, C50Eb (0-72 horas).
2.2. Comparación de las tasas de crecimiento
La tasa media de crecimiento específico (µ) de los cultivos con crecimiento exponencial puede calcularse como µ = (ln Nn − ln N0) / (tn − t0)
donde t0 es el momento del comienzo del ensayo.
Por otra parte, la tasa media de crecimiento específico puede derivarse de la pendiente de la línea de regresión en una gráfica de ln N en función del tiempo.
El porcentaje de inhibición de la tasa de crecimiento específico para cada concentración de la sustancia de ensayo () se calcula de acuerdo con la fórmula:
Iµt = ([µc − µc]/µc) ? 100 donde
µc = tasa media de crecimiento específico de los testigos
µt = tasa media de crecimiento específico a la concentración de ensayo t
El porcentaje de inhibición de la tasa media de crecimiento específico para cada concentración de sustancia de ensayo en relación con el valor de los testigos se representará en una gráfica en función de logaritmo de la concentración. La CE50 puede leerse en la gráfica resultante. Para expresar de forma inequívoca la CE50 obtenida por este método se propone utilizar el símbolo C50Er. Deben indicarse los momentos de medición, por ejemplo, si el valor se refiere a los momentos 0 y 72 horas, el símbolo será C50Er (0-72 horas).
Nota: La tasa de crecimiento específico es un término logarítmico, y pequeños cambios en la tasa de crecimiento pueden dar lugar a grandes cambios en la biomasa. Por ello, CEb y CEr son valores que no pueden compararse numéricamente.
2.3. Cálculo de la NOEC
La concentración sin efecto observado se determina mediante un procedimiento estadístico adecuado por comparación de muestras múltiples (p. ej., análisis de la varianza y prueba de Dunnett), utilizando los valores de las áreas bajo las curvas de crecimiento A (véase el punto 2.1) o las tasas de crecimiento específico µ (véase el punto 2.2) correspondientes a cada réplica individual.
3. INFORME
El informe de ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: –sustancia de ensayo: datos de identificación química,
–organismos de ensayo: origen, cultivo de laboratorio, número de cepa, método de cultivo, –condiciones del ensayo:
–fecha del comienzo y del final del ensayo y su duración, –temperatura,
–composición del medio, –equipo de cultivo,
–pH de las soluciones al comienzo y al final del ensayo (si se observa una diferencia de pH superior a 1,5 unidades, deberá adjuntarse explicación),
–vehículos y métodos utilizados para disolver la sustancia de ensayo y concentración del vehículo en las soluciones de ensayo,
–calidad e intensidad de la luz,
–concentraciones ensayadas (medidas o nominales), –resultados:
–densidad celular para cada matraz a cada tiempo de medición y método para medir la densidad celular, –valores medios de densidad celular,
–curvas de crecimiento,
–representación gráfica de la relación concentración/efecto, –valores de CE y método de cálculo,
–NOEC,
–otros efectos observados. 4. BIBLIOGRAFÍA
(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.
(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag «Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus», in: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
(3) ISO 8692 –Water quality– Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.
(4) S. Galassi y M. Vighi-Chemosphere, 1981, vol. 10, 1123-1126. Apéndice 1
Ejemplo de procedimiento para el cultivo de algas Observaciones generales
El objetivo del cultivo mediante el siguiente procedimiento es el de obtener cultivos de algas para ensayos de toxicidad. Deberán utilizarse métodos apropiados que garanticen que los cultivos de algas no están contaminados por bacterias (ISO 4833). Puede ser conveniente utilizar cultivos axénicos, pero serán esenciales los cultivos de una sola especie de alga.
Todas las operaciones deberán llevarse a cabo en condiciones estériles, con el fin de evitar la contaminación por bacterias u otras especies de algas. Se eliminarán los cultivos contaminados.
Procedimiento para la obtención de algas Preparación de soluciones nutritivas (medios)
El medio se puede preparar por dilución de las soluciones madre concentradas de nutrientes. Para un medio sólido, se añadirá un 0,8% de agar. El medio utilizado será estéril. La esterilización por autoclave puede dar pérdida de NH3.
Cultivos de inóculo
Los cultivos de inóculo son pequeños cultivos de algas que se trasfieren periódicamente a un medio de cultivo fresco para que actúen como elemento inicial del ensayo. Si los cultivos no se utilizan regularmente, se mantienen en tubos de agar inclinado y se transfieren a un medio fresco al menos cada dos meses.
Los cultivos de inóculo se cultivan en matraces cónicos que contengan el medio apropiado (un volumen alrededor de 100 ml). Cuando las algas se incuban a 20 °C con iluminación continua, será necesario hacer una transferencia semanal.
Durante la transferencia se llevará, con pipetas estériles, una cantidad de cultivo «viejo» a matraces con medio fresco, de manera que, con las especies de crecimiento rápido, la concentración inicial sea unas 100 veces menor que en el cultivo viejo.
La tasa de crecimiento de una especie puede determinarse a partir de la curva de crecimiento. Si se conoce, será posible calcular la densidad a la cual deberá transferirse el cultivo al nuevo medio. Esto deberá realizarse antes de que el cultivo alcance su fase letal.
Precultivo
El precultivo está concebido para obtener una cantidad apropiada de algas para la inoculación de los cultivos de ensayo. Dicho precultivo deberá incubarse en las condiciones del ensayo y se utilizará cuando esté aún en fase de crecimiento exponencial, normalmente después de un período de incubación de 3 días. Si los cultivos de algas contienen células deformadas o anormales, deberán eliminarse.
Apéndice 2
La norma ISO 8692: Calidad del agua; prueba de inhibición del crecimiento de algas en agua dulce utilizando Scenedesmus subspicatus y Selenastrum capricornutum da los siguientes resultados en una prueba multicéntrica llevada a cabo por 16 laboratorios, utilizando como sustancia de prueba el dicromato potásico.
– Medias (mg/l) Rango (mg/l)
C50Er (0-72 h) 0,84 de 0,60 a 1,03
C50Eb (0-72 h) 0,53 de 0,20 a 0,75
C.4. DETERMINACIÓN DE LA BIODEGRADABILIDAD «FÁCIL»