THE COST STRUCTURE AND THE EFFICIENT SIZE OF A DAM
1.4 Present Policies
Al llevar a cabo el análisis del espectro de RMN1H (Figura 35) del compuesto aislado a partir del pico IV de la fracción de AcOEt se determinó que el espectro presenta señales características de una 5,6-dihidro-α-pirona, los desplazamientos químicos y las constantes de acoplamientos se presentan en la Tabla 6, al ser comparados con las brevipólidas previamente reportadas en la literatura, se encontró que corresponde a la brevipólida H (Figura 36).34
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Figura 35. Brevipólida H
Tabla 6. Desplazamientos químicos en RMN-1H de la 5,6-dihidro-α-pirona aislada
(Brevipólida H) de Hyptis brevipes en CDCl3 (400 MHz).
Posición Brevipólida H δ H ( J en Hz) 3’proR 1.12 ddd (8.0, 6.3, 4.0) 3’proS 1.35 ddd (8.9, 4.0, 3.9) 7’ 1.54 d (7.0) 2’ 1.60 dddd (8.9, 6.3, 6.3, 3.4) 4’ 2.28 ddd (8.3, 3.9, 3.4) 5ec 2.53 dddd (18.6, 6.5, 4.0, 3.8) 5ax 2.71 dddd (18.6, 12.3,2.2, 2.0) 1’ 3.73 dd (6.3, 3.8) OCH3 3.84 s 6 4.53 ddd (12.3, 4.0, 3.8) 6’ 5.30 q (7.0) 3 6.04 ddd (9.7, 2.0, 0.8) 8” 6.38 d (16.0) 5” 6.91 d (8.9)a 3” 6.91 d (8.9)a 4 7.00 dd (9.7, 6.5, 2.2) 6” 7.49 d (8.9)a 2” 7.49 d (8.9)a 7” 7.70 d (16.0)
43 6.4.2 Caracterización del compuesto G2 (Brevipólida P)
En la Figura 37 se presenta el espectro RMN 1H del compuesto aislado a partir del
pico G2 de la subfracción G, en la que se identificaron las señales que permitieron la caracterización de la estructura de la 5,6-dihidro-α-pirona aislada, la cual corresponde a la Brevipólida P (Figura 38). En la tabla 8 se presentan los valores de desplazamiento químico y constantes de acoplamiento que confirmaron su identificación.
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Figura 37. Brevipólida P
Tabla 7. Desplazamientos químicos en RMN-1H de la 5,6-dihidro-α-pirona aislada
(Brevipólida P) de Hyptis brevipes en CDCl3 (400 MHz).
Posición Brevipólida P δH ( J en Hz) 3’proS 1.12 ddd (8.2, 6.6, 4.2) 3’proR 1.36 ddd (8.6, 3.8, 3.8) 7’ 1.54 d (7.0) 2’ 1.63 ddd (9.6, 6.4, 5.6, 4.2) 4’ 2.28 ddd (8.6, 3.8, 3.8) 5ec 2.52 dddd (18.3, 6.3, 3.8, 0.8) 5ax 2.70 dddd (18.3, 12.5, 2.2, 2.2) 1’ 3.67 dd (6.4, 3.8) OCH3 3.84 s, 3.99 s 6 4.53 ddd (12.3, 3.8, 3.8) 6’ 5.33 c (7.0) 3 6.03 ddd (9.7, 2.2, 0.8) 8” 6.30 d (15.9) 5” 6.86 d (8.2) 4 6.98 ddd (9.7, 6.3, 2.2) 6” 6.98 dd (8.0, 2.1) 2” 7.09 d (2.0) 7” 7.61 d (16.0)
45 6.5 Evaluación de citotoxicidad
Se realizó el ensayo de SRB de los compuestos aislados frente a las siguientes líneas celulares humanas: HCT-15 (carcinoma de colon), HeLa (carcinoma de cérvix), MCF-7 (carcinoma de mama) y PC-3 (carcinoma de próstata), los valores obtenidos de CI50 son presentados en la Tabla 8.
Tabla 8. Citotoxicidad de la Brevipólida H y P frente a diversas líneas celulares humanas.
Compuesto
Línea Celular Humana CI50 (µg/mL) HCT-15 HeLa MCF-7 PC-3 Brevipólida H 6.8 5.8 5.2 5.4 Brevipólida P >20.0 1.9 5.3 4.7 Colchicina 0.008 0.019 0.036 0.017 Vinblastina 0.002 0.001 0.004 0.001
46 7. DISCUSIÓN
A partir del extracto de las partes aéreas de una colecta de la especie Hyptis brevipes se obtuvieron dos compuestos derivados de las 6-heptil-5,6-dihidro-α-
pironas; en la que ambos presentan en su estructura un anillo de ciclopropano, y que han sido aislados previamente a partir de esta especie, conocidas como Brevipólida H y Brevipólida P.
El uso de las diversas técnicas cromatográficas es crítico para lograr la separación, el aislamiento y la purificación de los compuestos obtenidos; a lo largo del proyecto fueron utilizados desde cromatografía en capa fina para la visualización preliminar y monitoreo de las fracciones, la cromatografía en columna para lograr una separación más detallada y aprovechamiento de la muestra, y por último el uso de la cromatografía de líquidos permitió el aislamiento y purificación de los compuestos obtenidos.
A pesar de que la separación y aislamiento de los dos compuestos identificados se realizó de manera satisfactoria; en primera instancia la purificación realizada de los picos I-IV obtenidos a partir de la fracción de AcOEt presentó la pérdida consecutiva de cantidades significativas de muestra debido a una falla técnica del sistema de la válvula de reciclaje del CLAR, por lo que se obtuvieron rendimientos bajos. No obstante, de esta manera se consiguió el aislamiento y la purificación exitosa del compuesto mayoritario (Brevipólida H). Para lograr la obtención de la Brevipólida P, que había sido identificada en los cromatogramas de la fracción de AcOEt, como el perteneciente al compuesto del pico I, resultó necesario la
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aplicación de diversas estrategias cromatográficas con el remanente de muestra de la fracción de AcOEt, tales como la cromatografía en columna y el posterior uso del CLAR para la purificación por medio de la reinyección de la muestra.
Se ratifica que tanto la procedencia de la colecta como la época del año de la recolección de la planta influye en la concentración y diversidad de los compuestos generados a partir del metabolismo secundario, en este caso de las 5,6-dihidro-α-pironas, lo cual explica la presencia o ausencia de estos diferentes derivados a pesar de tratarse de la misma especie. Los meses de recolección de las plantas de Hyptis brevipes han sido de octubre a enero, y todas proceden del
estado de Veracruz. En general, existe una mayor variedad de estos compuestos en los meses de octubre y noviembre. En una colecta de Hyptis brevipes
proveniente del Km. 16 de la carretera Jalapa-Veracruz no se reportó la presencia de 5,6-dihidro-α-pironas36, mientras que las colectas provenientes de la localidad de Dos Ríos, han presentado mayor riqueza de brevipólidas.24, 34 En el presente
trabajo, fueron aislados dos brevipólidas a partir de una colecta procedente de Angostillo, recolectadas en el mes de enero.
Debido a que se ha encontrado que la actividad citotóxica es una característica importante de este tipo de compuestos, su evaluación frente a diversas líneas celulares humanas resulta de interés. La brevipólida H presentó mayor actividad citotóxica frente a MCF-7 (carcinoma de mama) mientras que la brevipólida P demostró mayor actividad citotóxica frente a HeLa (carcinoma de cérvix), aunque el rango de actividad se encuentra de 1.9 a 6.8 µg/mL, pero resalta el hecho de observar que la brevipólida P no demostró actividad frente al carcinoma de colon.
48 8. CONCLUSIONES
El estudio fitoquímico continuo de Hyptis brevipes contribuye a la caracterización
de sus metabolitos secundarios entre los que destacan los derivados de 5,6- dihidro-α-pironas debido a su actividad citotóxica, y cuyo género además de ser relevante por sus componentes fitoquímicos con actividad diversa, también destaca por su amplio uso en la historia de la medicina tradicional de diversos países, principalmente México, el cual presenta el mayor endemismo de las especies de éste género.
Se consiguió el aislamiento y la identificación de dos 6-alquil-5,6-dihidro-α-pironas en la que ambos compuestos presentan un anillo de ciclopropano, conocidas como Brevipólida H y Brevipólida P.
Aunado a los diversos estudios fitoquímicos realizados previamente acerca de las especies del género Hyptis, que han aportado y permitido la profundización de
conocimiento fitoquímico, el presente proyecto permitió la continuidad y comprensión acerca de la variada composición de compuestos químicos generados por metabolismo secundario, los cuales presentan actividad citotóxica frente a líneas celulares derivadas de carcinomas humanos, sin demostrar una selectividad marcada en el caso de la brevipólida H.
49 9. PERSPECTIVAS
Debido a que se ha encontrado que la especie Hyptis brevipes, tanto en
estudios previos y en el presente proyecto, contiene compuestos de interés como parte del metabolismo secundario, en particular, derivados de 5,6- dihidro-α-pironas, es importante continuar con el seguimiento de la investigación fitoquímica no sólo en dicha especie sino en el género.
La caracterización de 5,6-dihidro-α-pironas y otros metabolitos secundarios, a partir de colectas de distintas procedencias y épocas del año permitiría un mayor conocimiento de ésta especie en lo que respecta a la variabilidad química.
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Figura 7. (A) Placa de Libro. Dibujo. Hyptis brevipes. Fransisco Manuel Blanco. Flora de Filipinas. Gran Atlas I. 1880. (B) Fotografía Hyptis brevipes proveniente