El análisis de los resultados de la micromatriz se inició con una normalización de las señales de todas las hibridaciones mediante el programa DNMAD del paquete informático GEPAS (http://gepas.bioinfo.cipf.es/), restando a cada valor el ruido de fondo, y realizando una normalización Lowess dentro de cada micromatriz y entre las diferentes micromatrices, y una normalización por desviación estándar para que la desviación estándar de los puntos sea la misma entre diferentes bloques y entre diferentes cristales. Seguidamente, y mediante la aplicación PREPROCESSING incluida en GEPAS, se promediaron las señales de todos los clones pertenecientes a un mismo unigen. El análisis de expresión diferencial se realizó con el programa SAM (“Statistical Analysis of Micrcoarrays“) entre todos los tratamientos y SAM por parejas con FDR < 1%, implementados en el paquete de análisis MeV (“TIGR MultiExpression Viewer”), (http://www.tm4.org/mev.html).
Figura 32. Árbol jerárquico de los unigenes significativos obtenido a partir del
análisis SAM ("Significance Analysis of Microarrays") entre todas las condiciones de estudio: tratamiento con aire (AIRE), tratamiento con ET (ETILENO), herida (HERIDA) e infección con P. digitatum (INFECCIÓN), mediante el uso del programa MeV del paquete informático TM4.
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Una vez realizada la normalización de las señales de hibridación y analizada la presencia de réplicas técnicas, se analizaron 8.191 de los 8.384 genes presentes en la micromatriz. Hay que tener en cuenta que no todos los genes estaban secuenciados, de hecho 1.391 genes de los 8.191 no lo estaban, por lo que no se podría obtener información sobre su identidad. El análisis de la expresión de los unigenes presentes en la micromatriz, mediante el uso de herramientas informáticas, permitió confirmar la presencia de unigenes con perfiles de expresión diferencial para cada una de las condiciones de estudio (Figura 32) (Saeed et
al., 2003).
Otra forma de visualizar los resultados de los análisis de expresión diferencial consiste en la agrupación de genes según su inducción o represión en cada una de las condiciones de estudio o por combinación de ellas mediante la elaboración de diagramas de Venn (Figura 33).
Del total de 8.191 unigenes analizados en la micromatriz se encontraron 1.428 inducidos durante la infección (17 % del total de analizados), de los que 643 se indujeron además por la aplicación de ET (45 % de los inducidos por infección). También se encontraron 202 unigenes con inducción específica en herida y 482 en la condición de ET.
Al estudiar los 91 unigenes cuya expresión es específica en la respuesta a la infección, se observó que 46 de ellos no están secuenciados o tienen mala secuencia, y 17 no presentan homología con bases de datos. Entre los restantes 28 unigenes con homología, se encontró diferentes factores de transcripción, genes implicados en el metabolismo de fenilpropanoides y alcaloides como una flavanona 3- hidrolasa (unigen 856) y una ornitina descarboxilasa (unigen C02010H01), en la síntesis proteínas PR, como una PR-1b (unigen C02010A04), en el metabolismo de ROS, como una epóxido hidrolasa (unigen 5375) y algún gen de hongo, como el que codifica una “coiled-coil protein" (unigen 4935).
Es de resaltar que todas las categorías, tanto de inducción como de represión, están representadas por un número considerable de unigenes, los cuales están bastante homogéneamente repartidos entre las categorías, excepto las de inducción y represión conjunta por herida y ET, que son las menos numerosas con 76 y 44 genes, respectivamente. Las categorías más abundantes en inducción son la de ET -herida-infección y las específicas de ET y de infección, mientras que en represión es la
categoría específica de infección la que mayor número de genes presenta. En general, las categorías de inducción tienen más representantes que las de represión, excepto las categorías de infección y de ET e infección. Finalmente, cabe mencionar la presencia de genes que se inducen por un tratamiento y se reprimen por otro y que no están reflejados en los diagramas de Venn (véase material adicional), lo que da una idea de la complejidad de los mecanismos de regulación que operan en las condiciones de estudio.
Figura 33. Diagramas de Venn que muestran la distribución de los
genes presentes en la macromatriz según sus patrones de expresión diferencial, inducidos (A) o reprimidos (B) respecto a aire para las condiciones de herida, infección con P. digitatum (106 conidios/mL) o aplicación de ET exógeno (10 ppm). En la categoría de inducción, los círculos rojos indican el número de clones que sólo se expresan en la categoría a la que van unidos. Para el caso de represión, los círculos verdes indican el número de clones que solamente no se expresan en la categoría a la que van unidos. El análisis de los datos de hibridación se realizó con el programa informático GEPAS. El análisis estadístico se realizó con la herramienta SAM (Significance Analisis of Microarrays) con un FDR del 1%.
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En la Tabla 12 y la Tabla 13 se muestran los 20 genes con mayor inducción y con mayor represión en infección respecto a herida respectivamente, mostrando además su comportamiento en las condiciones de tratamiento con ET, infección y herida, respecto a aire. Entre los genes que más se inducen se encuentran los que codifican dos citocromo P450 79A02, que aunque comparten el mismo homólogo de A.
thaliana, no son un mismo gen, ya que tienen un nivel de identidad del
84%; dos CPRD2 que también se inducen por la herida; una sintasa de ácido tetrahidrocanabinólico, una nectarina, una fenilalanina amonio liasa, que también se induce por herida y en menor medida por ET, y una ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico oxidasa (ACO), que también está inducida por herida y ET. Es de resaltar que las proteínas CPRD2, ácido tetrahidrocanabinólico sintasa y nectarina 5 forman parte de una misma familia de proteínas que contienen un dominio de unión a FAD, pero los unigenes del CFGP son genes diferentes, ya que el nivel de identidad entre ellos es del 85-90%.
Tabla 12. Unigenes de la micromatriz con mayor inducción en infección respecto a
herida (FDR<1%). Para cada unigen, se muestra la relación entre su expresión en las condiciones de infección (I), etileno (E) y herida (W) respecto a aire (A), y de infección respecto a herida, como logaritmo en base 2 de sus cocientes (SAM; FDR<1%).
Proteína más similar Unigen Homólogo en
A. thaliana Log2 (I/W) Log2 (E/A) Log2 (W/A) Log2 (I/A)
Citocromo P450 79A2 6147 At5g05260 2,99 0,30 0,41 3,40 Proteína CPRD2 2332 At1g26390 2,43 -0,01 1,16 3,60 Proteína CPRD2 4436 At4g20820 2,25 0,36 1,48 3,73 Ácido tetrahidrocanabinólico
sintasa C04016A09 At5g44380 1,99 -0,13 0,30 2,29
Descarboxilasa 5
Tirosina/DOPA C04022H07 At4g28680 1,96 0,49 0,62 2,58 Citocromo P450 79A2 4408 At5g05260 1,93 0,06 0,67 2,60 Secuencia no disponible C05028G06 1,87 -0,14 0,24 2,11 Nectarina 5 3442 At5g44380 1,86 0,64 2,50 Secuencia no disponible C04016B10 1,81 0,15 1,05 2,86 Secuencia no disponible C05039C02 1,76 0,35 1,90 3,65 Secuencia no adecuada para BLAST C08006D11 1,67 0,81 0,77 2,44 Secuencia no disponible C08007D08 1,66 -1,06 0,08 1,74 Secuencia no disponible C04002B12 1,55 0,59 2,51 4,06
Precursor de peroxidasa 2218 At5g58390 1,54 0,59 0,21 1,75 Fenilalanina amonio liasa 6764 At2g37040 1,54 0,79 1,30 2,84 Ácido 1-aminociclopropano-
1-carboxílico oxidasa 4356 At1g05010 1,52 0,79 1,59 3,11 Secuencia no disponible C02013H11 1,47 1,20 1,68 3,14 3-desoxi-D-arabino-heptulo-
sonato 7-fosfato sintasa 5794 At4g39980 1,46 -0,12 0,76 2,21 Proteína ribosomal 60S L44 4837 At4g14320 1,45
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Tabla 13. Unigenes de la micromatriz con mayor represión en infección respecto a
herida (FDR<1%). Para cada unigen, se muestra la relación entre su expresión en las condiciones de infección (I), ET (E) y herida (W) respecto a aire (A), y de infección respecto a herida, como logaritmo en base 2 de sus cocientes (SAM; FDR<1%).
Proteína más similar Unigen Homólogo en
A. thaliana Log2 (I/W) Log2 (E/A) Log2 (W/A) Log2 (I/A)
Receptor de benzodiazepina 6697 At2g47770 -1,09 -0,70 0,94 -0,16 Proteína ATFP3 5942 At5g63530 -1,07 -1,12 -0,45 -1,52 Ptoteína ASR 6637 At4g35800 -0,96 -1,62 -0,67 -1,64 Secuencia no adecuada
para BLAST C04011A12 -0,91 -0,62 -1,08 -1,99 Proteína LEA5 5533 At4g15910 -0,90 0,39 -0,87 -1,77 Proteína DRM1 7035 At1g28330 -0,89 -1,46 -1,01 -1,90 Proteína T3F17.27 6980 At2g46080 -0,88 0,00 0,30 -0,58 Proteína DRM1 7102 At1g28330 -0,88 -1,44 -0,94 -1,81
Secuencia no disponible 6766 -0,87 -0,59 -1,24 -2,11 Dehidrina (LEA) 5584 At1g76180 -0,86 -0,29 -0,45 -1,31 Dicianina 4987 At5g40970 -0,86 -1,03 -0,53 -1,40 Proteína LEA5 7050 At4g02380 -0,86 0,00 -1,03 -1,89 Secuencia no adecuada
para BLAST C04002F10 -0,85 -0,22 -0,07 -0,91
Secuencia no adecuada
para BLAST C04004E08 -0,84 0,04 -1,25 -2,08 Secuencia no adecuada
para BLAST C03006B08 -0,83 -0,09 0,10 -0,73 Pentatricopéptido 1650 At3g59300 -0,79 -0,02 0,10 -0,69
Proteína desconocida 5046 At5g03880 -0,78 0,01 -0,20 -0,98 ATPasa 1 transportadora de
fosfolípidos 2397 At5g04930 -0,78 0,14 -0,51 -1,29 Secuencia no disponible 3133 -0,78 -0,58 -0,81 -1,59 Secuencia no adecuada
Entre los genes que más se reprimen se encuentran los que codifican un receptor de benzodiazepina, que sin embargo está bastante inducido por herida, tres proteínas LEA (dehidrina) que presentan también una represión considerable por herida, dos proteínas DRM1 que también sufren represión por herida y ET y una dicianina, cuya expresión está reprimida considerablemente por ET. Además, hay varios genes sin homología o con secuencia no disponible, con altos niveles de represión por infección, que también están regulados por herida y/o ET.