PRESENTATION OF FINANCIAL STATEMENTS i) Basis of Presentation :

La muestra de trigo duro de 50 variedades, que formaban 23 casos de duplicados potenciales, se empleó para determinar la utilidad de las proteínas del endospermo y de los SSRs para detectar y confirmar duplicados. En todos los casos, las accesiones de un duplicado tenían el mismo nombre local, y en el caso de las variedades locales el mismo nombre, origen histórico y geográfico. Así mismo, se disponía, para todas las accesiones, de información de un trabajo previo (Ruiz y Aguiriano, 2004) para 30 caracteres agro-morfológicos utilizados en la identificación de variedades y recomendados por IBPGR (1985) (Tabla 6 Cap. 3). Ruiz y Aguiriano (2004) analizaron 277 accesiones de 106 duplicados comparando los perfiles de gliadinas y la caracterización agro-morfológica. En algunos casos, los datos de gliadinas y agro- morfológicos eran coincidentes (Figura 2); sin embargo, en otros, las accesiones eran similares en gliadinas pero se diferenciaban en varios caracteres agro-morfológicos, por lo que se necesitaba más información para tomar alguna decisión.

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Figura 2. Siembra de los duplicados potenciales en el CRF-INIA.

En esta tesis todos los duplicados potenciales se analizaron con 8 loci de proteínas, 6 de gliadinas y dos de gluteninas HMW (Tabla 1 Cap. 3) y 24 SSRs (Tabla 4 Cap. 3). Los SSRs se seleccionaron por su distribución en los distintos cromosomas del trigo. Este número de marcadores es comparable al que utilizaron Virk et al. (1995), quienes demostraron que 26 marcadores polimórficos fueron suficientes para detectar, con una probabilidad del 99%, por lo menos una diferencia entre dos variedades de arroz sospechosas de ser duplicadas. Por otro lado, la información del análisis de la proteína total permitió la cobertura de un área más amplia del genoma, ya que las proteínas del endospermo están controladas por los 7 grupos de cromosomas (Fra-Mon et al., 1984; Singh y Skerritt, 2001).

La similitud genética entre los duplicados se analizó siguiendo los mismos criterios que para el análisis de las entradas heterogéneas; no más de un locus diferente de proteínas y distancias menores que la mínima encontrada entre dos accesiones distintas. Esta similitud se cumplía para diferencias de 3 o menos SSRs. Por tanto, los valores de corte para los parámetros genéticos fueron los mismos que los fijados para los biotipos (Tabla 1).

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Veintiuno de los 23 duplicados potenciales analizados presentaron un único genotipo (gt. 1) con todos los marcadores proteicos (Tabla 1 Cap. 3) y se diferenciaron en menos de 3 caracteres agro-morfológicos (Figura 3). Estos caracteres agro- morfológicos eran, en general, menos discriminantes (hábito de la hoja bandera, hábito de la espiga madura y longitud de gluma) o afectados por las condiciones ambientales (pigmentación de las anteras) (Ruiz y Aguiriano, 2004). Dieciocho de estos 21 duplicados potenciales mostraron pocas diferencias con los SSRs (de 0 a 3 alelos distintos). Seis de ellos fueron duplicados idénticos, sin que se haya apreciado ninguna diferencia con ninguno de los marcadores moleculares empleados. No es común encontrar duplicados exactos en colecciones conservadas ex situ, ni siquiera en especies autógamas como el trigo.

Figura 3. Espigas y perfil electroforético de dos accesiones de Blanquillón de Boñar. Un caso de duplicado potencial confirmado.

En tres casos, se encontraron discrepancias en la variación detectada con proteínas y con los SSRs. Las accesiones de los duplicados de Alaga, Berberisco y Forment, que presentaron el mismo genotipo con todas las proteínas, se diferenciaron en

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más de tres alelos de SSRs; sin embargo, estas accesiones presentaron menores distancias entre ellas que con otras entradas, lo que confirma que se trataba de materiales genéticamente relacionados. Las dos accesiones de Alaga (Fig. 4) parecen ser agro-tipos con diferencias en días a espigado y color del grano. Es posible, que en el pasado fueran intencionadamente separadas de la muestra original, debido a que las diferencias eran apreciables a simple vista, dando lugar a dos accesiones diferentes en esos caracteres. Tranquilli et al. (2000) también encontraron una variedad local de trigo con considerables diferencias agro-morfológicas, e iguales en gluteninas HMW y en isoenzimas. La diversidad agro-morfológica la atribuyeron a una selección artificial llevada a cabo en la zona de origen.

5.

Figura 4. Espigas y perfil electroforético de dos accesiones de Alaga, idénticas en proteínas y diferentes en el color del grano y en días a espigado. Un caso de duplicado potencial en el que los genotipos están estrechamente relacionados.

Los dos casos de duplicados en los que las accesiones no presentaron el mismo genotipo con proteínas, Mindum (Figura 5) y la accesión 3 de Semental, difirieron en 19 y 16 SSRs, respectivamente (Tabla 2 Cap. 3). Las accesiones de Mindum se

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diferenciaron solo en el color de la barba y la altura de la planta, por lo que los marcadores moleculares fueron útiles para confirmar que las accesiones son muy diferentes.

Figura 5. Perfil electroforético de 10 granos de las dos accesiones de Mindum. Un caso de duplicado potencial no confirmado, con diferente genotipo de gliadinas.

En unos pocos casos, se detectaron discrepancias entre los índices genéticos utilizados con los SSRs, sJ y dGP, en la verificación de los duplicados. En algunos casos fue debido a la incidencia de alelos nulos que incrementaba el valor de dGP, como ocurrió con tres duplicados que se verificaron con el sj y no con la dGP (Hymera, Fanfarrón y la accesión 2 de Rubio de Badajoz) (Tabla 2 Cap. 3). Por el contrario, dos duplicados potenciales, Berberisco y Forment, que se diferenciaban en 4 alelos de SSRs, se confirmaron solo con la dGP. En esta ocasión, se debió a que los alelos no compartidos tenían un tamaño semejante, lo que indicó que a pesar de diferenciarse con el sj, sí que había una relación estrecha entre los genotipos comparados. En el resto de los casos, se detectó una gran concordancia entre ambos índices. El sJ al seguir un modelo de alelos infinitos considera que no existe homoplasia. La homoplasia en los

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SSRs daría lugar a alelos con el mismo tamaño que podrían considerarse iguales cuando en realidad existen diferencias en la secuencia de nucleótidos. Esto provocaría una sobrestimación de la similitud genética. Esta sobrestimación no se ha reflejado en los resultados de esta tesis, ya que se observó una correlación significativa entre el sJ y la dGP. Posiblemente, el efecto de la homoplasia se minimizó debido al uso de SSRs dinucleótidos y con motivos de repetición compuestos como sugirieron Maccaferri et al. (2003). En los casos en que se produjeron discrepancias los dos índices aportaron información complementaria. La dGP mostró ser muy útil, (siempre que no se incluyeran alelos nulos en el análisis), para detectar relaciones genéticas entre accesiones en aquellos duplicados que se han ido diferenciando con el tiempo, pero que provienen de un material común.

En general, se ha encontrado gran concordancia entre las proteínas, los caracteres agro-morfológicos y los SSRs, especialmente cuando las diferencias entre los genotipos eran grandes. Los tres tipos de proteínas empleadas han sido una excelente herramienta para detectar duplicados. El análisis de proteínas tiene la ventaja de que los requerimientos, tanto económicos como humanos, son menores. Sin embargo, cuando la información de las proteínas y los caracteres agro-morfológicos no fue suficiente para resolver la duplicación, los SSRs aportaron información muy útil, indicando que es aconsejable evaluar el germoplasma con diferentes tipos de marcadores genéticos.

Por otro lado, la identificación de alelos tiene la ventaja de poder comparar genotipos y detectar más fácilmente errores, como ocurrió con una accesión de Semental que se correspondía con la variedad Recio de Baza. Es frecuente que en los Bancos, sobre todo si se manejan muchas variedades, durante la manipulación de las muestras se produzcan errores y se pierda la correspondencia entre los datos de pasaporte y el material conservado en las cámaras. La detección y resolución de estos errores es muy importante para la racionalización de las colecciones y la utilización de las mismas.

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5.Caracterización genética con proteínas del endospermo con influencia en la