1.1. Introducción
Véase Introducción general, Parte B. 1.2. Definición
Véase Introducción general, Parte B. 1.3. Sustancias de referencia Ninguna.
1.4. Principio del método
Pueden utilizarse sistemas de cultivo de células de mamífero para descubrir mutaciones provocadas por sustancias químicas. Entre las líneas celulares de mayor uso figuran las células de linfoma de ratón L5178Y y las líneas celulares CHO y V-79 del hámster chino. En estas líneas celulares, los sistemas de uso más común determinan las mutaciones en los loci de la timidinquinasa (TK), la hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (HPRT) (Antes HGPRT) y la Na+/K+ ATPasa. Los sistemas mutacionales TK y HPRT revelan mutaciones de pares de bases, mutaciones por desplazamiento del marco de lectura del código genético (frameshift mutations) y delecciones pequeñas por su parte, el sistema Na+/K+ sólo descubre las mutaciones de pares de bases.
Las células deficientes en timidinquinasa (TK) a causa de la mutación directa TK+/TK− son resistentes a la bromodeoxiuridina (BrdU), a la fluorodesoxiuridina (FdU) o a la trifluorotimidina (TFT), ya que estos antimetabolitos no son incorporados a los nucleótidos celulares por la timidinquinasa del sistema enzimático de «salvamento»; los nucleótidos necesarios para el metabolismo celular sólo se obtienen mediante síntesis de novo. No obstante, en presencia de timidinquinasa, se incorporan a los nucleótidos BrdU, FdU o TFT, con las consiguientes inhibición del metabolismo celular y citotoxicidad. Así pues, las células mutantes proliferan en presencia de BrdU, FdU o TFT, al contrario que las normales, que contienen timidinquinasa. De igual modo, las células deficitarias en HPRT son seleccionadas por resistencia a la 8-azaguanina (AG) o a la 6-tioguanina (TG). Las células con Na+/K+ ATPasa alterada se seleccionan por resistencia a la cuabaina.
La citotoxicidad se averigua determinando el efecto de la sustancia estudiada sobre la capacidad para formar colonias (eficacia de clonado) o los índices de crecimiento de los cultivos. La frecuencia de mutantes se establece mediante la siembra de un número conocido de células en un medio que contenga agente selectivo para descubrir las células mutantes, y en un medio que no lo contenga para determinar las células supervivientes. Tras un período de incubación apropiado, se cuentan las colonias. Las frecuencias de mutantes se calculan a partir del número de colonias mutantes, y en función del índice de supervivencia celular.
1.5. Criterios cualitativos Ninguno.
1.6. Descripción del método Preparativos
Células
Pueden utilizarse para este ensayo líneas celulares diversas, entre las que cabe citar los subclones de L5178Y, las células CHO o V-79, con sensibilidad demostrada a los mutágenos químicos, gran eficacia de clonado y frecuencia de mutación espontánea escasa. Pueden examinarse periódicamente las células empleadas para comprobar la estabilidad del cariotipo y la inexistencia de contaminación por mycoplasma. Es posible recurrir a otros tipos celulares, siempre que esté perfectamente comprobada su validez para poner de manifiesto mutaciones génicas inducidas por vía química.
Medio
Se utilizarán medios de cultivo y condiciones de incubación adecuados (p. ej., temperatura, recipientes de cultivo, concentraciones de CO2 y humedad). Medios y sueros se elegirán en función de los sistemas selectivos y el tipo celular empleados en el ensayo.
Sustancia estudiada
La sustancias analizadas pueden prepararse en los medios de cultivo, o disolverse o suspenderse en vehículos apropiados antes de tratar las células. La concentración final del vehículo en el sistema de cultivo no debe influir en la viabilidad ni en el índice de crecimiento de las células.
Activación metabólica
Las células han de exponerse a la sustancia analizada en presencia y ausencia de un sistema de activación metabólica exógena de mamífero apropiado. Cuando se utilicen tipos celulares con actividad metabólica intrínseca, deberá tenerse la certeza de que el índice y la naturaleza de la actividad son adecuados para la clase química objeto de estudio.
Condiciones del ensayo
Uso de controles negativos y positivos
Se iniciarán en cada experimento controles positivos, utilizando una sustancia de acción directa y otra que precise activación metabólica; se empleará asimismo un control negativo (vehículo).
A continuación damos ejemplos de sustancias que pueden utilizarse como controles positivos: –compuestos de acción directa:
–etilmetanosulfonato –hicantona
–compuestos de acción indirecta: –2-acetilaminofluoreno
–7,12-dimetilbenzantraceno –N-nitrosodimetilamina.
Si se considera oportuno, se incluirá un control positivo extra perteneciente a la misma clase química que la sustancia estudiada.
Concentraciones de exposición
Se utilizarán varias concentraciones de la sustancia estudiada. Las empleadas deben provocar un efecto tóxico relacionado con la concentración; la concentración máxima originará una supervivencia escasa, y la mínima, una supervivencia semejante a la observada en el control negativo.
Las sustancias relativamente insolubles en agua se estudiarán hasta su límite de solubilidad mediante métodos apropiados. En lo que respecta a las sustancias tóxicas claramente hidrosolubles, la concentración máxima se determinará en cada caso.
Procedimiento
El número de células utilizadas por cultivo debe estar en relación con la frecuencia de mutaciones espontáneas; la regla general consiste en emplear un número de células viables igual a diez veces la inversa de la frecuencia de mutaciones espontáneas.
Las células se expondrán durante un período suficiente, que en la mayoría de los casos será de 2-5 horas. Las células que no tengan actividad metabólica intrínseca suficiente se expondrán a la sustancia objeto de estudio en presencia y ausencia de un sistema de activación metabólica apropiado. Al final del período de exposición, se lavan las células hasta eliminar la sustancia estudiada, y se someten luego a cultivo para determinar la viabilidad y permitir la expresión del fenotipo mutante.
Al terminar el período de expresión, que será suficiente para permitir una expresión fenotípica casi óptima de los mutantes inducidos, se cultivan las células en un medio, con agentes selectivos (y sin ellos), para determinar tanto el número de mutantes como la viabilidad.
Todos los resultados se confirman en un experimento independiente. 2. RESULTADOS
Los resultados se expondrán en forma de tablas en las que aparezcan los recuentos por placa, para la sustancia estudiada y los controles, en lo que respecta a la inducción de mutación y a la supervivencia. Se indicarán también el número medio de colonias por placa y la desviación estándar. La frecuencia de mutación se expresará como número de mutantes por número de células supervivientes. El índice de supervivencia y las eficacias de donado se expresan en porcentaje del valor control.
3. INFORME
3.1. Datos del ensayo
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible:
–línea celular utilizada, número de cultivos celulares, métodos de mantenimiento de los cultivos celulares
–condiciones de ensayo: composición de los medios, concentración de CO2, concentración de la sustancia estudiada, vehículo usado, temperatura de incubación, período de incubación, longitud del período de expresión (incluido el número de células sembradas, los subcultivos y los programas de aporte nutritivo, si procede), duración del tratamiento, densidad celular durante él, tipo de sistema de activación metabólica de mamífero utilizado, controles positivo y negativo, agente selectivo utilizado
–justificación de la elección de las dosis
–método empleado para enumerar las células viables y mutantes –evaluación estadística
–comentario de los resultados –interpretación de los resultados. 3.2. Evaluación e interpretación Véase Introducción general, Parte B. 4. REFERENCIAS
Véase Introducción general, Parte B.
B.18. LESIÓN Y REPARACIÓN DE DNA-SÍNTESIS DE DNA NO PROGRAMADA-CÉLULAS DE MAMÍFEROS IN VITRO