Problem formulation

Se parte de dos péptidos sintéticos, uno correspondiente al extremo N-terminal de LGI1FL_{: EGPPEYKKRKINSLSSKDFD (P01) en}

posición 201-220, que se denominó P01C258 y el otro perteneciente al dominio C-terminal: KAKFVKFQELNVQAPR (P03) en posición 505-522 que se denominó P03C262.

Los péptidos fueron adquiridos de la compañía DiverDrugs conjugados a la molécula transportadora KLH (Keyhole limpet

hemacyanin) y se inyectaron en conejos de la raza New Zealand. Tras

obtener suero preinmune para cada animal, los conejos fueron inmunizados cada tres semanas, con un total de seis inmunizaciones. Las inmunizaciones se realizaron subcutáneamente en la región cérvico-dorsal, inyectándose cada animal con 180 μg de péptido conjugado, en 1 ml de una emulsión que contiene PBS y adyuvante de Freund completo en la primera inmunización e incompleto en las restantes (Sigma-Aldrich).

2.2 Extracción del suero

Once días después de la última inmunización se procede a la sangría de los animales mediante canulación de la arteria carótida, obteniéndose aproximadamente 180 ml de sangre por conejo. La sangre

extraída se deja coagular dos horas a temperatura ambiente seguida de una incubación a cuatro grados toda la noche. El sobrenadante resultante se decanta y se centrifuga a 10.000 g durante 30 minutos a 4ºC.

2.3 Purificación de la fracción de las inmunoglobulinas

Precipitación por sulfato amónico. El sobrenadante obtenido

se sometió a una precitación con sulfato amónico saturado hasta el 50%, el sulfato amónico se añade lentamente gota a gota en agitación hasta el porcentaje deseado, a continuación se incuba durante 30 minutos a 4ºC en agitación y se centrifuga a 10.000 g durante 15 minutos a 4ºC. Para su conservación a largo plazo, el precipitado resultante se resuspendió en sulfato amónico al 50% añadiendo 0´3 ml por cada ml de suero de partida, manteniéndolo en todo momento 4ºC (Montoya et al. 1987).

Purificación de las IgGs por columna de Proteína A-sefarosa.

Las IgGs se purificaron por cromatografía en columnas de ProtA- Sepharose de 1 ml de capacidad (HiTrap Protein A HP, Amersham Biosciences). Se toma el volumen de suero precipitado correspondiente a 20 mg de IgGs (asumiendo una concentración de 10 mg IgG/ml suero y teniendo en cuenta el número de veces que el suero se concentró con la precipitación por sulfato amónico) y se centrifuga a 13.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC, se retira el sobrenadante y el pellet se resuspende en tampón de unión (20mM fosfato sódico pH 7) y se somete a una diálisis de 12 horas a 4ºC frente al tampón de unión. Una vez preparada la muestra se siguen las instrucciones proporcionadas por el fabricante para la purificación de las IgGs por la columna Hitrap Protein A HP, obteniéndose 10 fracciones de elución (tampón de elución: ácido cítrico 0´1 M pH 3) a las que se añadió Tris HCl 1M pH 9 para neutralizar el pH del tampón de elución y obtener un pH de conservación de 7.

Se cuantifican mediante el método de Bradford para cuantificación de proteínas las distintas fracciones de elución de la columna y se juntan las dos fracciones que contienen proteína (IgGs).

Purificación de las IgGs específicas contra LGI1FL _mediante columna de afinidad por antígeno. (SulfoLink Kit, Pierce). El

primer paso es la inmovilización de cada uno de los péptidos P01 y P03 a la matriz de la columna a través del grupo –SH que tiene cada uno péptido en su extremo terminal con el grupo iodoacetil de la matriz generando una unión covalente irreversible. Para ello se disolvieron 10 mg de péptido (sin conjugar a KLH) en 2 ml de tampón de unión subministrado por el fabricante que se aplicaron a cada columna. A continuación se pasó 1 mg de IgGs (P01C258 o P01C262) por la columna correspondiente a su péptido y por afinidad se recuperaron únicamente las IgGs que reconocen el antígeno eluyendo en 8 fracciones de 1ml con tampón de elución (100 mM Glicina pH 3) a las que se añadió Tris HCl 1M pH 9 para neutralizar el pH del tampón de elución y obtener un pH de conservación de 7.

2.4 Caracterización de los anticuerpos.

2.4.1 Inmunocitoquímica

La especificidad de los anticuerpos se comprobó realizando inmunocitoquímica de fluorescencia con los anticuerpos primarios P01C258 y P03C262 y un anticuerpo secundario conjugado a Cy3 sobre cultivos de células COS7 transfectados de forma que expresaran transitoriamente una proteína de fusión constituida por la secuencia codificante de LGI1FL _{fusionada a la Proteína Fluorescente Verde (GFP).}

Mediante microscopía confocal se demostró la colocalización de la señal fluorescente verde proveniente de la proteína LGI1FL_{·GFP y la señal}

fluorescente roja proveniente de la inmunocitoquímica con los anticuerpos anti-LGI1. Los detalles sobre la obtención de las construcciones se aportan en el apartado 3.3.2 mientras que los

detalles experimentales de la transfección se detallan en el apartado 5.2.

2.4.2 Western-blot

En este apartado se detalla la obtención de las muestras para la realización del western blot

Preparación de extractos totales. Se sacrificaron ratones Swiss

CD1 wt por luxación cervical para la extracción del cerebro y páncreas. Éstos son lavados en PBS 1X frío y homogeneizados en tampón de lisis RIPA (NaCl 1’5 M, NP-40 1%, Deoxicolato 0’5%, SDS 1%, Tris 50mM pH 8) al que previamente se le había añadido un cocktail de inhibidores de proteasas y fosfatasas (complete) y 1 mM de ortovanadato sódico), 4ml/g de peso húmedo, en un homogeneizador de vidrio. Se incuba durante 20 min a 4ºC para solubilizar las proteínas y a continuación se centrifuga a 13.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. Se recupera el sobrenadante y se cuantifica la concentración de proteínas mediante el kit Biorad DC Protein Assay.

Subfraccionamiento proteico. Tras extraer el cerebro y lavarlo

en PBS 1X frío, se homogeneiza en tampón de homogeneización (0´32 M Sacarosa, 10 mM Hepes) en un homogeneizador de vidrio, y se centrifuga a 3.000 g durante 10 minutos a 4ºC, descartándose el pellet. El sobrenadante se vuelve a centrifugar a 25.000 g durante 10 minutos a 4ºC. El pellet es tratado con tampón de lisis RIPA, y vuelto a centrifugar, recuperando el sobrenadante, en esta fracción se encontrarían las proteínas de mitocondrias, parte del retículo endoplasmático y sinaptosomas (fracción I). Mientras que el sobrenadante se vuelve a centrifugar a 35.000 rpm durante 1 hora a 4ºC, el sobrenadante contiene las proteínas citoplasmáticas (fracción II), y el pellet es tratado con tampón de lisis RIPA, y vuelto a centrifugar, recuperando el sobrenadante, donde se encuentran las proteínas de membrana (fracción III).

3. CONSTRUCCIONES