La genotipificación de los ADN-HPV amplificados con los cebadores SPF10 se realizó mediante el kit de INNOLiPA (Innogenetics, Bélgica). Este kit incluye, además del sistema de primers SPF10 y el C+, las tiras de hibridación reversa o LiPA con una cartilla de interpretación para determinar el tipo o los tipos de HPV presentes en las muestras cervicales. Entre los tipos de HPV que LiPA permite identificar se encuentran: 11 tipos de BR (6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 70, 74) y 14 tipos de AR (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 and 68)
Debido a que este kit es de reciente utilización y que aún se encuentra en proceso de estandarización, se reflejan a continuación las instrucciones de la casa comercial para la correcta utilización del mismo y para minimizar al máximo las posibilidades de contaminación:
Manipulación de las tiras LiPA.
1. Las tiras han sido diseñadas para usarlas una sola vez.
2. No tocar las tiras con los dedos, usar guantes limpios y desechables cada vez. M C+ C-
65 200 100
3. Para la identificación de las tiras utilizar lápiz de grafito. No usar rotuladores. Escribir la identificación por encima de la línea de marcaje de la tira.
4. Colocar las tiras en las bandejas con la membrana hacia arriba (se indica la posición en la tira).
5. Durante los diferentes pasos de incubación, las tiras deben permanecer dentro de la misma bandeja.
6. Las tiras que no se utilicen deben protegerse de la luz y el calor. 7. Evitar que las tiras recién usadas se sequen completamente antes de
su interpretación, cubriéndolas y almacenándolas.
8. Las tiras usadas deben almacenarse preferiblemente en la oscuridad a temperatura ambiente (20-25 ºC).
9. No reutilizar las bandejas (canales individuales para las tiras). Instrucciones para la incubación.
La hibridación y lavados deben realizarse exactamente a 49ºC±0.5, esta temperatura es la indicada para evitar FALSOS POSITIVOS (temperatura inferior) o FALSOS NEGATIVOS o muy débiles (temperatura superior).
1. Siempre mantener tapado el baño durante las incubaciones para evitar falsos negativos.
2. No debe usarse ventilador caliente para la hibridación y lavados. 3. La amplitud del movimiento generado tanto en el baño (hibridación y
lavados) y el rotador (desarrollo del color) es crítica para alcanzar la máxima sensibilidad y tinción homogénea.
4. Para la hibridación y los lavados, las bandejas deben colocarse sobre una plataforma para baño. Ajustar el nivel del agua entre un tercio y un medio de la altura de la bandeja. Asegurarse de que las bandejas no flotan en el agua. El agua deberá estar en contacto directo con las bandejas.
5. Los pasos de incubación para el desarrollo del color deben realizarse entre los 20-25ºC. Si la temperatura está por debajo de 20ºC podrían obtenerse resultados muy débiles. Si la temperatura está por encima de 25ºC podrían obtenerse señales de fondo y/ o falsos positivos.
6. Los tiempos específicos de incubación deben respetarse estrictamente.
2.4.3.5.1. Protocolo de hibridación reversa sobre tira (LiPA).
Antes de iniciar el proceso de la hibridación reversa en tira con los productos amplificados por PCR-SPF10, realizamos los siguientes pasos: a.- Calentamos el baño a 49ºC.
b.- Precalentamos a 37ºC la solución de hibridación y la solución de lavado. c.- Identificamos tantas tiras como casos a examinar con su respectivo número identificación e igualmente dispusimos del mismo número de canales o bandejas.
1. Con unas pinzas estériles tomamos el número de tiras para la prueba de acuerdo al número de muestras (1 tira por muestra) y rotulamos la tira con el número de identificación asignado a cada producto de PCR-SPF10 sobre la línea de marcaje.
2. Colocamos en el baño de 49 ºC tantos canales como muestras para genotipificación (1 canal por tira).
3. Colocamos 10 µl de solución de desnaturalización en la parte superior de cada canal y agregamos 10 µl del producto biotinilado amplificado, mezclamos cuidadosamente por pipeteo, varias veces. Incubamos a temperatura ambiente (20- 25º C) durante 5 minutos.
4. Agitamos la solución de hibridación precalentada y agregamos cuidadosamente 2 ml a la mezcla anterior en cada canal. Mezclamos por agitación cuidadosamente.
5. Colocamos inmediatamente la tira en el canal respectivo cuidando de que se sumergiera completamente en la solución. 6. Colocamos los canales en el baño a 49ºC, tapamos el baño
para evitar la evaporación y dejamos incubando 1 hora. 7. Lavado:
• Después de la hibridación, retiramos los canales del baño. • Aspiramos el líquido del canal con una pipeta. Agregamos 2
canal y enjuagamos por agitación de los canales entre 10 y 20 segundos a temperatura ambiente. Aspiramos la solución de cada canal.
• Añadimos de nuevo 2 ml de solución de lavado astringente precalentada e incubamos las tiras 30 minutos en el baño de 49ºC.
2.4.3.5.2 Desarrollo del color.
Todas las incubaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente, en un agitador orbital.
1. Lavamos las tiras 2 veces durante 1 minuto con 2 ml de Solución Rinse diluido 1:5 en agua destilada y aspiramos con la pipeta.
2. Agregamos 2 ml del Conjugado diluido 1:100 en solución de conjugado e incubamos durante 30 minutos mientras se agitaba. Aspiramos.
3. Lavamos 2 veces más durante 1 minuto con 2 ml de Solución de Rinse y luego 1 vez con 2 ml de Solución Sustrato Buffer. Aspiramos. 4. Añadimos 2 ml Sustrato diluido 1:100 en solución del sustrato e
incubamos 30 minutos en agitación mientras se desarrollaba la reacción de color púrpura.
5. Detuvimos la reacción añadiendo 2 ml de agua destilada. Repetimos la operación mientras se agitaba por lo menos 3 minutos cada vez para retirar el exceso de líquidos.
6. Secamos las tiras en papel absorbente.
Figura Nº 19. Secuencia del proceso de hibridación reversa en tira (LiPA) para genotipificación de ADN-HPV en las muestras de cáncer de cuello uterino incluidas en nuestro estudio.
2.4.3.5.3 Interpretación de los resultados.
Las tiras fueron interpretadas una vez secas usando la plantilla. Para la interpretación de los resultados se tuvieron en cuenta las siguientes instrucciones:
1. La primera línea es la línea del Control del Conjugado