The proposed DNN ensemble system

El proceso de conversión de glucosa se realizará empleando la caja de luz CROSS LINKER® CL-508 de UVITEC CAMBRIDEGE para proporcionar la radiación UV de 254 nm en la cual se adoptó un contenedor para las soluciones y se agregó el agitador magnético como se muestra en la Figura 27 (Jaime-Acuña, et al., 2016). Las muestras se agitarán a 300 rpm y se programará el fotoreactor para aplicar radiación ultravioleta por dos horas o más. Se cargarán 30 ml de cada una de las muestras de análisis.

La caja de luz posee varios ajustes manuales como son: energía de radiación en Joules, tiempo de radiación. En este proyecto se utilizará el tiempo de radiación en minutos.

Figura 27. Fotoreactor de 254 nm de radiación UV. Modificado de Jaime-Acuña, et al., 2016.

3.4.2. Cromatografía Líquida

La cromatografía líquida (LC del inglés Liquid Chromatography) es una técnica de separación molecular que involucra:

• La inyección de un pequeño volumen de muestra

• Pasar la muestra por un tubo empaquetado con partículas porosas (la fase liquida)

• Transportar por gravedad los componentes de la muestra con un líquido a un tubo empaquetado (la columna).

Los componentes de la muestra son separados unos de otros por la columna empacada la cual involucra interacciones físicas y/o químicas entre las moléculas de la muestra y las partículas del empaque. Las componentes separadas de la muestra se recogen a la salida de la columna de empaque y se identifican por alguna técnica de medición, como la espectrofotometría la cual mide la intensidad de los colores, o por algún otro dispositivo que puede medir la cantidad de muestra separada. Comparando esta técnica con la Cromatografía Liquida de Alto Rendimiento (HPLC del inglés High Performance Liquid Chromatography), esta última es una técnica de separación que involucra:

• La inyección de pequeñas cantidades de una muestra liquidad en un tubo empacado con pequeñas partículas de 3 a 5 micrómetros (µm) en diámetro, llamada fase estacionaria.

• Las componentes de la muestra son movidos por un líquido (la fase móvil) a una columna empacada (la columna) por una bomba de alta presión.

Las componentes son separadas por la columna y por la interacción de las componentes físico y/o químicos de las moléculas de la muestra y las partículas del empaque de la columna. Los componentes separados son detectados a la salida de la columna por un detector y con una computadora se genera un cromatograma.

En principio la LC y la HPLC funcionan del mismo modo excepto por la velocidad, la eficiencia, la sensibilidad y la fácil operación del equipo de HPLC haciendo esta última técnica superior que la LC.

El análisis por cromatografía liquida se realizará en un equipo HPLC 1100 de Agilent, ver la figura 28. El método de operación del HPLC depende de los componentes que serán analizados. Por ejemplo, para carbohidratos que difieren del que se usa para proteínas. El método de operación contempla el tipo de columna de separación, el volumen de inyección de la muestra, la temperatura de operación, el flujo que se requiere para operar la bomba y el tipo de detector de especies en una muestra. Existen varios tipos de detectores como son el detector de índice de refracción (DIR), el detector de longitud de ondas múltiple (DLM), el detector de fluorescencia, entre otros. Para nuestro proyecto se usarán los dos primeros, el DIR y el DLM. En este estudio se usará el siguiente método de operación del HPLC 1100, Agilent:

Columna: ZORBAX, Análisis de Carbohidratos, 4.6 mm x 150 mm (5µm) Fase Móvil: 75/25 de Acetonitrilo/Agua de grado HPLC

Velocidad de Flujo: 0.8 mL/min Temperatura: 30 0_C

Detectores: HP1100 DIR, DLM (230 nm de longitud de onda) Volumen de Muestra Inyectada: 20 µL

Componentes del HPLC

Las principales componentes del cromatógrafo de alto desempeño se muestran en la figura 28. El HPLC empleado es un cromatógrafo de alta presión. La función de la bomba (1) es empujar el líquido (la fase móvil o solventes) por el cromatógrafo a una velocidad de flujo específico, que se expresa en mililitros por minuto (mL/min). El flujo normalmente es de 1 a 2 mL/min y la presión de la bomba puede ser de 400 a

600 bar. En un experimento de cromatografía, la bomba puede suministrar una composición constante de la fase móvil (flujo isocrático), o una composición de la fase móvil creciente (flujo de gradiente). El inyector (2) sirve para introducir la muestra líquida dentro del flujo de corriente de la fase móvil y los volúmenes de muestra que se inyectan son de 5 a 20 microlitros (µL) y el inyector debe de poder resistir la alta presión del líquido del sistema. Una automuestra es una versión automática para cuando se tienen varias muestras para analizar o cuando la inyección manual no es muy práctica. La columna (3) se considera el “corazón del cromatógrafo”; la fase estacionaria de la columna separa las componentes de interés en la muestra, usando varios parámetros físicos y químicos. Las pequeñas partículas dentro de la columna son las que causan la despresurización en un flujo normal. La bomba debe empujar fuerte para mover la fase móvil por la columna, lo cual causa la alta presión en el cromatógrafo. El detector (4) puede detectar las moléculas que van saliendo de la columna, estos sirven para medir la cantidad de los componentes de una muestra y genera los datos que llegan a la computadora, la cual genera los cromatogramas relativos a los componentes en una muestra.

El HPLC se usa óptimamente en la separación de compuestos químicos y biológicos que son no-volátiles como son:

• Sales como cloruro de sodio; fosfato de potasio

• Productos naturales como extractos de plantas, hierbas medicinales, etc. • Compuestos orgánicos como polímeros, polietileno, etc.

• Farmacéutico como tylenol, aspirina, etc.

Cromatogramas

Los cromatogramas en la Figura 29 muestran los picos de los frentes, que son los solventes de la fase móvil que arrastra los compuestos de análisis a través del HPLC. La identificación de un compuesto individual se efectúa con el parámetro más común, el tiempo de retención en minutos que corresponde al tiempo después de la inyección de una muestra. Dependiendo del detector que se use, la identificación de un compuesto se basa por su estructura química, peso molecular o algún otro parámetro molecular. En un análisis cuantitativo la cantidad de un compuesto se determina por su concentración; en un cromatograma se determina la altura de los picos medidos desde la línea base y se determina el área de los picos en cada cromatograma. Para hacer un análisis cuantitativo de un compuesto determinado, se inyecta el compuesto de interés con una composición conocida y se mide la altura del pico o el área del pico. En este estudio se usará el área de los picos.

Para analizar residuos o trazas de compuestos que son difíciles de separar o de detectar, se requiere una alta resolución de separaciones y detectores muy sensibles. Estos compuestos por lo general se presentan en un cromatograma con picos muy pequeños y/o área de los picos muy pequeñas, con concentraciones en peso del 1% o en partes por millón (ppm) o en concentraciones más bajas.

La tabla 3 sugiere observar los tiempos de retención de los posibles productos en el proyecto que pueden ser azucares y sus derivados. Los resultados se obtuvieron utilizando un equipo Waters Alliance 2695 HPLC con detector de índice de refracción (DIR) tipo Waters.

Tabla 3. Tiempos de retención(TR) de algunos carbohidratos. Reportados por SpectraLab, 2016.

Azúcar Clasificación TR(min) Altura, X104_nRIU

xilosa monosacárido 5.1 2.5

fructosa monosacárido 5.5 3.3

sorbitol Alcohol de azúcar 6.1 2.9

manitol Alcohol de azúcar 6.3 3.0

galactosa monosacárido 6.7 1.6

glucosa monosacárido 6.8 3.1

sucrosa disacárido 9.4 2.5

lactosa disacárido 10.9 1.5