Proposed Integration Framework

secuencias a la especie receptora, inclusión de secuencias reguladoras homólogas a la especie receptora

(En concordancia con la etapa 1 del Análisis de riego de plagas (ARP) para plagas cuarentenarias, incluido el análisis de riesgos ambientales y organismos vivos modificados NIMF. 11; apartado, 1.3 INFORMACIÓN para los OVM. La información aquí presentada es la necesaria para que la DGSV realice el análisis de riesgos conforme a la NIMF. 11)

Esta información se describió a detalle anteriormente (Apartado 1.11: Descripción de las secuencias flanqueantes, número de copias insertadas, y los resultados de los experimentos que comprueben los datos anteriores), sin embargo para beneficio del lector, se presenta la síntesis de la información antes detallada:

1.18.1 Híbrido de maíz BT11 x MIR162 x MIR604 x GA21

El híbrido de maíz con la tecnología BT11 x MIR162 x MIR604 x GA21 es un híbrido F1 resultado de la cruza convencional de las líneas de maíz con las tecnologías:

 BT11, resistente a ciertos lepidópteros plaga del cultivo de maíz y tolerante a glufosinato;

 MIR162, resistente a ciertos lepidópteros plaga del cultivo de maíz;

 MIR604, resistente a ciertos coleópteros plaga del cultivo de maíz;

 GA21, tolerante a herbicidas a base de glifosato.

Para corroborar la herencia de los rasgos dada la cruza convencional, se realizaron análisis Southern a fin de confirmar la integridad de los insertos de las líneas parentales de maíz BT11, MIR162, MIR604 y GA21 en el híbrido de maíz con la tecnología BT11 x MIR162 x MIR604 x GA21, encontrándose que estos se heredaron sin ninguna modificación no esperada.

El propósito del estudio fue confirmar la integridad de los insertos genéticamente modificados en el maíz Bt11 x MIR162 x MIR604 x GA21 a través de análisis Southern Blot. El evento de maíz Bt11 x MIR162 x MIR604 x GA21 fue producido por entrecruzamiento convencional de plantas de maíz derivadas de los eventos de transformación: Bt11 de maíz, MIR162 de maíz, MIR604 de maíz y GA21 de maíz.

El análisis Southern Blot se realizó utilizando técnicas de biología molecular estándar. Cada Southern blot contenía un control positivo y un control negativo. El control positivo se incluyó para demostrar la sensibilidad de cada experimento; el control negativo, ácido desoxirribonucleico (ADN) extraído de plantas cultivadas de semillas de maíz convencionales (sin modificación genética), fue incluido para identificar las posibles secuencias endógenas de ADN que hibridaran con la sonda. El ADN genómico extraído de los eventos de maíz Bt11, MIR162, MIR604, GA21 y Bt11xMIR162xMIR604xGA21, y el ADN de maíz convencional fue

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Para comparar los patrones de hibridación del evento Bt11xMIR162xMIR604xGA21 con los patrones de hibridación correspondientes a los eventos simples, se utilizaron nueve sondas gen- específicas:

• Una sonda específica al gen cry1Ab • Una sonda específica al gen vip2Aa19 • Una sonda específica al gen mcry3A • Una sonda específica al gen mepsps • Una sonda específica al gen pmi • Una sonda específica al gen pat

El ADN genómico de maíz fue digerido con una enzima que corta dentro del inserto correspondiente al evento simple; los otros sitios de reconocimiento para esta enzima se localizaron en el genoma de maíz flanqueante (colindante) al inserto del evento simple.

Se observaron los patrones de hibridación de ADN esperados en todos los análisis Southern blot de los eventos Bt11, MIR162, MIR604, GA21 y Bt11xMIR162xMIR604xGA21, así como en el maíz convencional (sin modificación genética). En todos los análisis Southern blot, los patrones de hibridación de ADN del evento Bt11xMIR162xMIR604xGA21 correspondieron a las bandas hibridadas observadas para los eventos simples. Lo anterior demostró que la integridad de los insertos de los eventos simples fue preservada durante el entrecruzamiento convencional que produjo el evento de maíz apilado Bt11xMIR162xMIR604xGA21.

Los datos de los análisis de hibridación de Southern demostraron que en el híbrido de maíz con las tecnologías BT11 x MIR162 x MIR604 x x GA21 se encuentran copias únicas de los genes cry1Ab, pat, vip3Aa20, mcry3A, pmi y mepsps, y que estos son estables a lo largo de varias generaciones.

A continuación se describe la información de cada evento parental que dio origen al maíz con las tecnologías BT11 x MIR162 x MIR604 x GA21.

1.18.2 Evento parental BT11 1.18.2.1 Regiones codificadoras

1.18.2.1.1 Gen cry1Ab (también denominado Btk)

El gen cry1Ab presente en el evento SYN-BT-Ø11-1 una versión sintética y modificada del gen completo inicialmente aislado de Bacillus thuringiensis var. kurstaki cepa HD-1. El fragmento tiene un tamaño de 1.8 Kb. Las modificaciones sufridas por el cry1Ab incluyen modificaciones y truncaje de la secuencia del ADN diseñados con el fin de mejorar su expresión en plantas. Dichas modificaciones no tuvieron como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos.

1.18.2.1.2 Gen pat

El gen que codifica la enzima fosfinotricin-acetil transferasa (pat) se aisló y caracterizó a partir de la cepa Tu494 del microorganismo de suelo Streptomyces viridochromogenes (Strauch et al., 1988). La secuencia nativa (Wohlleben et al., 1988) fue modificada para optimizar su

expresión en plantas. Las modificaciones incluyen cambios en el codón de iniciación, pasando del nativo GTG al ATG, así como numerosos cambios en distintos codones con el propósito de disminuir el contenido en GC. Estos cambios a nivel de ADN se realizaron sin alterar la secuencia de aminoácidos de la proteína. El gen modificado fue proporcionado a Novartis por el Dr. Peter Eckes del Hospital General de Massachusetts (Boston, MA, USA) en forma del plásmido pOCA/Ac.

De forma breve vamos a explicar cómo se originó el plásmido pOCA/Ac. El gen pat había sido previamente clonado en forma de fragmento SalI insertado en el plásmido pDH51 (Pietrzak et al., 1986). El plásmido pDH51 deriva del plásmido de la serie pUC y contiene una versión de 530 pares de bases del promotor 35S y un terminador NOS de 220 pares de bases. La totalidad de la región genómica había sido previamente clonada como un fragmento EcoRI (de tamaño aproximado 1,3 kb) e insertada en el sitio EcoRI del plásmido pOCA18 (Olszewski et al., 1988) dando como resultado pOCA/Ac. Novartis aisló el fragmento del mediante el enzima de restricción EcoRI para ser subclonado en el plásmido pBluescript KS+ (obtenido de la compañía Stratagene, Inc. y derivado del plásmido pUC19), dando como resultado el plásmido pZO350. Más tarde, el gen fue nuevamente subclonado desde el pZO350 en forma de fragmento Sal I - Pst I y combinado con otros fragmentos procedentes del plásmido pZO1083. La región genómica pat fue entonces subclonada desde el plásmido pZO1083 hacia el sitio Bgl II del plásmido pZO997 (véase el apartado Plásmido pZO1502 que antecede).

1.18.2.2 Regiones no codificadoras 1.18.2.2.1 Promotores 35S

Los promotores 35S se derivan del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV), (Gardner et al., 1981; Franck et al., 1980). Se trata de un promotor constitutivo por lo que los genes que se expresan bajo su control, se expresan en prácticamente la mayoría de los tejidos de la planta. El 35S-1 se derivó a partir del CM1841 del Virus del Mosaico de la Coliflor aislado (CaMV) (Gardner et al., 1981). Dicho promotor se encuentra en un fragmento de 500 bp que ha sido manipulado par ser clonado con los genes de interés apropiados.

El 35S-2 se derivó a partir de la cepa Cabb-S del CaMV (Franck et al., 1980) en forma de fragmento AluI-DdeI (de un tamaño aproximado 425 pares de bases), cuyos extremos fueron sometidos a las modificaciones necesarias para su clonaje con los genes de interés.

1.18.2.2.2 Intrones

Los intrones derivan del gen 1S, que codifica la enzima alcohol-deshidrogenasa del maíz (Freeling y Bennett, 1985). La utilización de estos intrones permite mejorar la expresión génica heteróloga tal como ha sido descrito con anterioridad (Mascarenhas et al., 1990).

1.18.2.2.3 Terminadores

El terminador NOS está constituido por los pares de bases 423-678 del gen de la nopalina-sintetasa de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983) con la adición de sitios de

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1.18.3 Evento parental MIR162 1.18.3.1 Regiones codificadoras 1.18.3.1.1 Gen vip3Aa19

El gen vip3Aa19 es una versión modificada del gen nativo vip3Aa1 (Estruch et al., 1996) encontrada en la bacteria del suelo Bt cepa AB88. El gen vip3Aa19 fue modificado para alojar al codón seleccionado para el uso en maíz (Murray et al., 1989). El gen vip3A19 (Entrez™ Accession Number DQ539887 (NCBI, 2006)) codifica la proteína Vip3Aa19 y difiere de la proteína Vip3Aa1 en un solo aminoácido en la posición 284. El gen vip3Aa1 codifica lisina en la posición 284 y el gen vip3Aa19 codifica glutamina. La proteína Vip3Aa confiere resistencia a varios insectos lepidópteros.

1.18.3.1.2 Gen pmi

La proteína PMI que expresa el gen pmi, cataliza la isomerización de manosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato (Negrotto et al., 2000) y permite que las células de maíz transformadas utilicen la manosa como una fuente de carbono alternativa.

1.18.3.2 Regiones no codificadoras 1.18.3.2.1 Promotor ZmUbilnt

Región del promotor del gen poliubicuitina de Zea mays, incluyendo el primer intrón. Proporciona expresión constitutiva en monocotiledóneas (Christensen et al., 1992).

1.18.3.2.3 Intrones

 iPEPC9: Intrón número 9 del gen fosfoenolpiruvato carboxilasa de Z. mays (Hudspeth and Grula, 1989).

1.18.3.2.2 Terminadores

 CaMV35S terminador: Secuencia del terminador del virus del mosaico de la coliflor. Su función es proveer una secuencia de poliadenilación (Franck et al., 1980).

 NOS: Secuencia del terminador del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium

tumefaciens. Su función consiste en proveer un sitio de poliadenilación (Depicker et al.,

1982).

1.18.4 Evento parental MIR604 1.18.4.1 Regiones codificadoras 1.18.4.1.1 Gen mcry3A

El gen mcry3A es un gen optimizado con maíz sintético del Bacillus thuringiensis subespecie tenebrionis. La secuencia de nucleótidos también fue modificada para incluir un sitio de reconocimiento de catepsina G proteasa que comienza en la posición 155 de la secuencia de aminoácidos de la proteína Cry3A nativa (Chen y Stacy, 2003).

1.18.4.1.2 Gen pmi

La proteína PMI que expresa el gen pmi, cataliza la isomerización de manosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato (Negrotto et al., 2000) y permite que las células de maíz transformadas utilicen la manosa como una fuente de carbono alternativa.

1.18.4.2 Regiones no codificadoras 1.18.4.2.1 Promotores MTL y ZmUbilnt

Ambos promotores provienen de Zea mays; el primero derivado del gen similar a la metalotioneína y que proporciona la expresión preferencial en raíz de Zea mays (De Framond, 1991), y el segundo derivado del gen poliubiquitina, conteniendo el primer intrón, proporcionando la expresión constitutiva en monocotiledóneas (Christensen et al., 1992).

1.18.4.2.2 Terminadores

El terminador NOS está constituido por los pares de bases 423-678 del gen de la nopalina- sintetasa de Agrobacterium tumefaciens, (Bevan, et al, 1983) con la adición de sitios de restricción. Estas regiones son necesarias para que la maquinaria de traducción reconozca el fin del gen.

1.18.5 Evento parental GA21 1.18.5.1 Regiones codificadoras 1.18.5.1.1 Gen m-epsps

El gen mepsps codifica para una enzima 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintasa doble mutada (mEPSPS), aislada del maíz (Zea mays L.). El fragmento tiene un tamaño de 1.34 Kb. Las modificaciones realizadas al gen mepsps incluyeron: mutagénesis puntual para disminuir la sensibilidad de la enzima al glifosato y la fusión a un péptido de tránsito optimizado que permite el direccionamiento celular de la proteína mEPSPS a los cloroplastos, organelo en el que la ruta metabólica del shikimato se lleva a cabo. La secuencia del péptido de tránsito al cloroplasto es derivado de los genes de la 1,5-bifosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCo) del maíz y del girasol. 1.18.5.2 Regiones no codificadoras

1.18.5.2.1 Promotor de la actina de arroz

Con el fin de dirigir la expresión del gen insertado se empleó la secuencia 5’ del promotor de la actina 1 de arroz, que incluye el primer intrón. (McElroy et al., 1990). Este promotor promueve la expresión constitutiva de la proteína en todos los tejidos de la planta de maíz.

1.18.5.2.2 Terminadores

El terminador NOS está constituido por los pares de bases 423-678 del gen de la nopalina- sintetasa de Agrobacterium tumefaciens, (Bevan et al., 1983) con la adición de sitios de restricción. Estas regiones son necesarias para que la maquinaria de traducción reconozca el fin del gen.