Quarterly cost assignment

La familia II se caracteriza por poseer un motivo característico de secuencia GDSL distinto del pentapéptido clásico Gly-x-Ser-x-Gly, encontrado en la mayoría de las enzimas lipolíticas. Las enzimas GDSL tienen cinco bloques consenso (I-V) y en cada bloque un aminoácido conservado esencial para la catálisis, normalmente serina, glicina, asparagina, aspartico e histidina. Esta secuencia de aminoácidos da lugar a la subfamilia denominada hidrolasas-SGNH (Akoh et al. 2004). Esta subfamilia engloba a lipasas, proteasas, esterasas, tioesterasas, lisofosfolipasas, arilesterasas, aciltransferasas y carbohidrato esterasas (Alalouf et al. 2011). La secuencia consenso que las da el nombre [GDS(L)] se localiza en el bloque I. La serina catalítica se encuentra en este bloque cercana al N-terminal de la proteína, a diferencia de lo que ocurre con las lipasas con motivo Gly‐x‐Ser‐x-Gly, donde la serina se encuentra en el centro de la proteína (Bornscheuer 2002) En el proceso catalítico, la serina nucleofílica actúa donando un protón al agujero oxianiónico. La glicina y la asparagina son donadores de protones para la formación del agujero oxaniónico, la histidina desprotona a la serina haciéndola más reactiva y el aspártico se encarga de estabilizar la carga positiva de la histidina catalítica (Akoh et al. 2004).

Otra característica esencial de estas enzimas es la ausencia de codo nucleófilo y la presencia de un sitio activo flexible que se adapta a la unión de los diferentes sustratos y que sólo cambia de conformación una vez que el sustrato se ha unido. En este contexto han sido descritas enzimas con actividad lipasa y proteasa motivada por esta alta flexibilidad (Bornscheuer 2002). Debido a esta amplia especificidad de sustrato, estas enzimas poseen un gran potencial para su uso en la hidrólisis y la síntesis de compuestos ésteres de interés farmacéutico, alimentario, bioquímico y biológico (Akoh et al. 2004).

Estas enzimas, además, no tienen homología con las lipasas con plegamiento típico α/β. La estructura descrita para las lipasas/esterasas GDSL está constituida por varias láminas β y hélices α orientadas de forma alterna, situando el sitio de unión al sustrato entre la lámina β central y una hélice α (Figura 5). Otra diferencia destacable entre las lipasas α/β hidrolasas y los miembros de la subfamilia II es la orientación de los residuos catalíticos en la estructura de la proteína. En las lipasas de tipo α/β hidrolasas, los residuos de la tríada catalítica se alinean en paralelo a la hoja β central, mientras que en las lipasas GDSL, la línea de la tríada catalítica se localiza perpendicularmente a la hoja β central (Figura 6). Esta disposición no parece afectar a la función catalítica de la enzima debido a que serina nucleófilica en el carbono carbonílico se conserva en su posición (Wei et al. 1995).

Figura 5. Distribución de la estructura secundaria en (a) la ramnogalacturonano acetilesterasa (RGAE) de Aspergillus aculatus (familia II) y (b) un pliegue típico de lipasas hidrolasa α/β hidrolasas. Fuente: Figura tomada de Mølgaard et al. (2000a).

Figura 6. Orientación de los residuos de la tríada catalítica con respecto al pliegue total. (a) Estructura de la dienolactasa hidrolasa (Pathak and Ollis 1990), una α/β hidrolasa, vista desde el lado N-terminal de la hoja β central. Los tres residuos catalíticos se alinean aproximadamente en paralelo a la hoja β central (b) RGAE perteneciente a la familia II vista desde una orientación similar. Los residuos

catalíticos se alinean casi perpendiculares a la hoja β central. Fuente: Figura tomada de Mølgaard et

al. (2000a)

En general, las proteínas de la familia GDSL son proteínas con un peso molecular aproximado de 22-60 kDa, aunque algunas tienen múltiples sitios de glucosilación con mayor peso molecular.

I.2.3. Familia III

A esta familia pertenecen las enzimas extracelulares de las diferentes especies de los géneros

Streptomyces y Moraxella (Cruz et al. 1994; Feller et al. 1990; Pérez et al. 1993). Las lipasas de

esta familia tienen una masa molecular de 32-35 kDa y muestran gran similitud con isoformas monoméricas del factor de activación de plaquetas acetilhidrolasa de seres humanos (PAF-AH) (Arpigny and Jaeger 1999).

I.2.4. Familia IV

Esta familia está constituida por esterasas de microorganismos procariotas psicrófilos, mesófilos o termófilos que presentan una elevada similitud con la familia de lipasas sensibles a hormonas de mamíferos (HSL) (Hemilä et al. 1994). Estas enzimas se caracterizan por poseer una secuencia consenso His-Gly-Gly-Gly involucrada en la catálisis de la enzima (De Simone et al. 2000; Manco et al. 1999) y por mostrar actividad solo hacia ácidos grasos de cadena corta (Chahinian et al. 2005) Varias esterasas de esta familia (De Simone et al. 2000; De Simone et al. 2001; Zhu et al. 2003; Derewenda et al. 1999) han mostrado una estructura única consistente en una “cubierta” que difiere notablemente de la “tapadera” de las lipasas verdaderas (Wang et al. 2005).

I.2.5. Familia V

Los miembros de esta familia proceden de bacterias mesófilas (Pseudomonas oleovorans,

Acetobacter pasteurianus y Haemophilus influenzae), psicrófilas (Moraxella sp.) y termófilas

(Sulfolobus solfataricus). Una peculiaridad de estas enzimas es que muestran una similitud moderada, que comprende entre el 20% y el 25% con otras enzimas bacterianas no lipolíticas, tales como las dehalogenasas y las haloperoxidasas. Se caracterizan por presentar una triada catalítica formada por residuos de serina, ácido glutámico o aspártico e histidina y el plegamiento característico de las α/β-hidrolasas (Arpigny and Jaeger 1999).

I.2.6. Familia VI

Esta familia está compuesta principalmente por enzimas con pesos moleculares comprendidos entre 23 y 26 kDa (Arpigny and Jaeger 1999; Kim et al. 2006). Se trata de enzimas que comparten una similitud de aproximadamente el 40% con las lisofosfolipasas de organismos eucariotas. A esta familia también pertenecen enzimas carboxilesterasas caracterizadas por presentar una amplia especificidad de sustrato. Al igual que las familias IV y V, poseen tres bloques característicos con dominios conservados (Arpigny and Jaeger, 1999; Lenfant et al. 2013).

I.2.7. Familia VII

La familia VII está compuesta por esterasas con un peso molecular de aproximadamente 55 KDa. Todas las enzimas de esta familia presentan una elevada homología con acetilcolinesterasas de eucariotas y carboxilesterasas del intestino e hígado (Arpigny & Jaeger, 1999). Todas las enzimas de este grupo son producidas por varias cepas de los géneros Bacillus, Paenibacillus y

Geobacillus (Nthangeni et al. 2005). Entre los sustratos típicos de estas carboxilesterasas se

I.2.8. Familia VIII

Esta familia está formada por enzimas que tienen una masa molecular de unos 42 kDa y una elevada homología con algunas β-lactamasas de clase C (Elend et al. 2006; Nishizawa et al. 1995; Schütte and Fetzner 2007).

En este grupo, la serina nucleofílica se encuentra en el motivo Ser-X-X-Lys (Petersen et al. 2001). Los miembros de esta familia se caracterizan por presentan alta tolerancia a diferentes disolventes y un motivo adicional en el extremo C-terminal (Elend et al. 2006; Schütte and Fetzner 2007).

1.2.9 Familias IX - XVI

Las enzimas pertenecientes a la familia IX contienen un pentapéptido conservado constituido por los residuos Ala-X-SerX-Gly (Handrick et al. 2001). Las pertenecientes a las familias X y XII poseen un pentapéptido conservado formado por los residuos Gly-X-Ser-X-Gly (Bassegoda et al. 2012); Kim et al. 2009; Levisson et al. 2007). Los miembros de las familias XI y XIII se caracterizan por presentar un motivo conservado formado por los residuos Gly-X-Ser-X-Gly-Gly (Ewis et al. 2004; Lee et al. 2006; Liu et al. 2014). La familia XIV posee el pentapéptido Cys-His- Ser-Met-Gly (Rao et al. 2011). Algunas proteínas de la familia XV contienen un pentapéptido conservado Gly-His-Ser-Gln-Gly, mientras que otras contienen una nueva variación de esta secuencia Ser-His-Ser-Gln-Gly (Bayer et al. 2010; Lee et al. 2010). Las enzimas pertenecientes a la familia XVI tienen un plegamiento α/β-hidrolasa típico, con Ser-His-Asp constituyendo la triada catalítica y una “cubierta” muy pequeña que forma una α-hélice y un lazo desordenado (Fu et al. 2013).

1.2.10. Nuevas familias de enzimas lipolíticas

Familia XVII

La lipasa extracelular LipJ2 producida por la bacteria halotolerante Janibacter sp. R02 fue la primera proteína identificada como miembro de esta nueva familia. Esta proteína consta de un peso molecular de 44 kDa y es homóloga a lipasas producidas por los géneros Arsenicicoccus,

Dermatophilus y Janibacter (Castilla et al. 2017). Se caracterizan por poseer una tríada catalítica

típica formada por Ser-His-Asn y un pentapéptido conservado Gly-Tyr-Ser-Gln-Gly alrededor de la serina catalítica.

Familia XVIII

La esterasa EstUT1 producida por la bacteria termófila Ureibacillus thermosphaericus fue la primera enzima clasificada en la nueva familia XVIII de enzimas lipolíticas (Samoylova et al. 2018). Esta enzima tiene un peso molecular de 28 kDa, y se caracteriza por poseer una tríada catalítica compuesta por los residuos típicos Ser-His-Asn y un pliegue α/β-hidrolasa. También se define por su alta especificidad hacia los esteres de ácidos grasos de cadena corta (C2, C4) y presenta baja actividad hacia ésteres de ácidos grasos de 12 átomos de C.

Familia XIX

El descubrimiento de la lipasa termoestable LipSm de Stenotrophomonas maltophilia Psi-1 definió la familia XIX de enzimas lipolíticas (Parapouli et al. 2018). LipSm muestra más de un 48% de identidad con varias enzimas lipolíticas no caracterizadas de los géneros Pseudomonas

geniculata y P. aeruginosa, Stenotrophomonas pavanii, Gordonia sp. y Rhodococcus sp. Esta

enzima posee una tríada catalítica típica Ser-His-Asn y un péptido conservado Gly-His-Ser-Gln- Gly-Gly-Ala que rodea a la serina catalítica.

En el año 2010 se estimó que debían existir alrededor de 900 enzimas lipolíticas de origen bacteriano (Hausmann and Jaeger 2010). Desde entonces, este número ha ido aumentando de manera constante, superando hoy en día las 5000 enzimas identificadas. Cabe destacar que solo el 10% de estas enzimas han sido caracterizadas bioquímicamente, mientras que más del 90% han sido identificadas solo por similitud de secuencia.