En paralelo se estudió la densidad post-sináptica (DPS) y la longitud de la brecha sináptica en los 3 grupos experimentales a días 4 y 25.
El componente post-sináptico más prominente de las sinapsis excitadoras es la DPS, identificado como una estructura electron-densa difusa que se extiende en el citoplasma debajo de la membrana plasmática de este tipo de sinapsis (Harris y Weinberg, 2012). El análisis cuantitativo de diversos parámetros de la DPS reveló resultados interesantes. A día 25, los animales SD evidenciaron una reducción de la longitud de la DPS con un aumento concomitante en su espesor de manera que su área no cambió. Por el contrario, a día 4 no se observaron diferencias en la longitud, en el espesor o en el área de la DPS de los animales SD (Figura 14A). De esta manera estos resultados indican un cambio en la forma de la DPS (más corta y ancha) en los animales SD a día 25. Cabe mencionar que el área de la DPS se correlaciona casi perfectamente con el volumen de la cabeza de la espina y, por lo tanto, con el remodelado sináptico (Harris y Weinberg, 2012).
Resultados I
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Figura 12. Análisis del terminal pre-sináptico a día 25. (A) A día 25, no se observaron diferencias en el
número de vesículas sinápticas totales por terminal entre los grupos experimentales. Resultados similares se obtuvieron respecto al número de las vesículas de reserva y al área del terminal pre-sináptico. Sin embargo, el número de vesículas docked se redujo. Los resultados se expresan como los valores medios (± SEM) de 50-60 sinapsis correspondientes a 2-3 animales por grupo. (B) Las sinapsis del área CA3 se clasificaron en 3 categorías de acuerdo al número total de vesículas sinápticas por terminal (0-5, 6-20 y >20 vesículas sinápticas totales por terminal). A día 25 se observó en los animales SD un incremento de las poblaciones de sinapsis con bajo y alto número de vesículas con una reducción concomitante de la población con un número intermedio de vesículas.. (C) Un importante aumento del número de vesículas no clásicas se observó en los animales SD, particularmente en la población de sinapsis con intermedio y alto número de vesículas. Los resultados se expresaron como los valores medios (± SEM) de 5-30 sinapsis por población sináptica de 2-3 animales por grupo. (D) Fotografías de las sinapsis del área CA3 hipocampal de los 3 grupos experimentales a día 25 obtenidas por microscopía electrónica mediante post-fijación con tetróxido de osmio. El recuadro a mayor magnificación muestra las vesículas clásicas en los animales Control y SND, y las no clásicas en los animales SD. Cabeza de flecha, vesículas sinápticas. Escala de la barra = 0,2 µm.* P< 0,05 entre barras, prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis
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Figura 13. Análisis del terminal pre-sináptico a día 4. (A) No se observaron diferencias en el número de
vesículas sinápticas totales, en las docked o de reserva por terminal entre los grupos experimentales. Resultados similares se obtuvieron respecto al área del terminal pre-sináptico. Los resultados se expresan como los valores medios (± SEM) de 50-60 sinapsis correspondientes a 2-3 animales por grupo. (B) Las sinapsis del área CA3 se clasificaron en 3 categorías de acuerdo al número total de vesículas sinápticas por terminal (0-5, 6-20 y >20 vesículas sinápticas totales por terminal). A día 4 el perfil de vesículas fue similar en los 3 grupos experimentales. (C) En los animales SD a día 4 el número de vesículas no clásicas no difirió del resto de los grupos experimentales. Los resultados se expresan como los valores medios (± SEM) de 5-30 sinapsis por población sináptica de 2-3 animales por grupo. (D) Fotografías de las sinapsis del área CA3 hipocampal en los 3 grupos experimentales a día 4 obtenidas por microscopía electrónica mediante post-fijación con tetróxido de osmio. En el recuadro se observa a mayor magnificación las vesículas clásicas en los animales Control y SND, y las no clásicas en los animales SD. Cabeza de flecha, vesículas sinápticas. Escala de la barra = 0,2 µm. Todos los parámetros pre-sinápticos a día 4 se analizaron estadísticamente mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis.
Resultados I
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Figura 14. Análisis del terminal post-sináptico y de la longitud de la brecha sináptica. (A) A día 4 en los
animales SD no se encontraron cambios en la longitud, en el espesor o en el área de la densidad post- sináptica (DPS). Sin embargo, 21 días después disminuyó la longitud de la DPS mientras que el espesor aumentó, de tal manera que el área no se modificó. (B) La medición de la longitud de la brecha sináptica reveló un aumento en los animales SD a día 25, mientras que a día 4 no se observaron diferencias. Los resultados se expresan como los valores medios (± SEM) de 30-60 sinapsis de 2-3 animales por grupo. *** P< 0,001; * P< 0,05; ns, no significativo entre barras, ANOVA de una vía seguido de la prueba de Bonferroni.
La brecha sináptica es un espacio con material electron-denso que separa a la membrana plasmática del axón (pre-sinapsis) de la membrana de la dendrita (post-sinapsis). Sorprendentemente, a día 25 los animales SD evidenciaron un aumento de la longitud de la brecha sináptica respecto a la de los grupos Control y SND, mientras que entre los animales
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Control y SND no se encontraron diferencias significativas. Por el contrario, a día 4 no se observaron diferencian entre los 3 grupos experimentales (Figura 14B). Para estudiar con más detalle los cambios observados a día 25 en la brecha sináptica, se analizaron las sinapsis del área CA3 dibujando un triángulo rectángulo en el cual se definieron dos ángulos sinápticos (α y β), y dos distancias sinápticas, “a” y “d” (ver la sección de Materiales y Métodos) (Figura 15A). En los animales SD el ángulo α se encontró aumentado con una reducción simultánea en el ángulo β. No se observaron diferencias significativas entre los grupos Control y SND. Además, como se muestra en la figura 6B, la distancia “d” se mantuvo sin cambios mientras que la distancia "a" aumentó drásticamente en los animales SD.
Es importante mencionar que tanto los valores de la longitud de la brecha sináptica como los del área de la DPS obtenidos en este trabajo de Tesis concuerdan con los descritos por otros autores (Marrone y col., 2004; Rollenhagen y col., 2007; Sheng y Hoogenraad, 2007).
Figura 15. Ángulos y distancias sinápticas. A) Se analizaron las sinapsis del área CA3 dibujando un triángulo
rectángulo por medio del Teorema de Pitágoras. (B) EL ángulo sináptico α aumentó en los animales SD, mientras que el ángulo sináptico β disminuyó. Además, la distancia “d” se mantuvo sin cambios mientras que la distancia “a” aumentó en los animales SD. Los resultados se expresaron como los valores medios (± SEM) de 30-60 sinapsis de 2-3 animales por grupo. ** P< 0,01; ns, no significativo entre barras, ANOVA de una vía seguido de la prueba de Bonferroni
Resultados I
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Según lo presentado hasta aquí el análisis realizado por microscopia electrónica indica que en el área CA3 del hipocampo:
Los animales SD a día 25 presentan:
- Un perfil pre-sináptico alterado, caracterizado por un incremento en las poblaciones de sinapsis con bajo y alto número de vesículas. Esta última población representada por un alto porcentaje de vesícula de tipo no clásico.
- Curiosamente, un acortamiento de la longitud de la DPS en concordancia con el aumento de la distancia de la brecha sináptica en sus extremos.
- A pesar que la conducta de desesperanza está establecida a día 4 en los animales SD, no se evidencian cambios ultra-estructurales significativos.
3. La adquisición y la persistencia de la conducta de desesperanza se acompañan de una