Aunque E. coli puede ser modificada genéticamente para la producción de carotenoides, tan sólo dispone de pequeñas cantidades de precursores para la síntesis de isoprenoides que puedan ser utilizados para producir carotenoides. El IPP es una molécula esencial involucrada en la síntesis de quinonas y hopanoides (reguladores de las propiedades de las membranas) y bactoprenol (necesario para la producción de peptidoglicano de la pared celular). En varios trabajos se ha reportado un aumento en la producción de carotenoides al aumentar la cantidad de IPP y DMAPP disponible en huéspedes no carotenogénicos modificados biotecnológicamente mediante la sobreexpresión de DXS, el principal enzima regulador de la ruta MEP (Harker y Bramley, 1999; Matthews y Wurtzel, 2000). Sin embargo, el papel de otros enzimas de la ruta en el control del flujo metabólico de la misma ha sido poco explorado.
Con este objetivo se propuso sobreexpresar cada uno de los genes codificantes para los diferentes enzimas de la vía MEP utilizando las células EcAB4-1(Sauret-Gueto et al., 2003) como ejemplo de organismo bacteriano no carotenogénico. Estas células (fondo genético K12 MG1655) presentan en su genoma un operón sintético que contiene todos los genes de la vía del MVA necesarios para la conversión de esta molécula en IPP y DMAPP bajo el control de un promotor inducible por arabinosa lo cual permite un elevado control del nivel transcripcional de sus enzimas (Campos et al., 2001). A continuación los genes que codifican para los enzimas individuales de la vía del MEP, DXS, DXR, MCT, CMK, MDS, HDS y HDR (Figura 2), fueron clonados en el plásmido pQE-30. Este vector presenta un gen que confiere resistencia a ampicilina, un epítopo de 6 Histidinas localizado en N-terminal y un promotor inducible por IPTG. Para comprobar que la sobreexpresión de los diferentes genes producía una proteína funcional, células deficientes para genes individuales de la ruta del MEP fueron transformadas
con los plásmidos que contenían el gen del cual carecían. Dichas cepas presentan una disrupción en el gen codificante para los enzimas, de modo que sólo serán viables mediante la expresión de una proteína funcional. A diferencia de las células control (células transformadas con el plásmido pQE-30 vacío) las células transformadas con el plásmido correspondiente presentaban un crecimiento normal en placa, lo cual demostraba la funcionalidad de los distintos enzimas recombinantes. Con el objetivo de evaluar su papel en la producción de carotenoides, los plásmidos generados se usaron para transformar células E. coli EcAB4-1 conjuntamente con el plásmido pLYC (resistencia a cloramfenicol) (Rodriguez-Villalon et al., 2008) que contiene los genes procedentes de Erwinia uredevora CrtE (GGPP sintasa), CrtB (fitoeno sintasa) y CrtI (fitoeno desaturasa) los cuales conferían la capacidad de sintetizar licopeno a partir de IPP y DMAPP (Cunningham et al., 1993). Las células cotransformadas con pLYC y cada uno de los plásmidos con genes de la ruta MEP se seleccionaron en placas suplementadas con cloramfenicol y ampicilina. Tres colonias transformantes para cada uno de los enzimas individuales de la ruta del MEP (que presentaban una coloración rosada característica del licopeno) se emplearon para inocular cultivos líquidos de 3 ml que crecieron a 37ºC durante 15 horas. Al día siguiente, aquellos dos cultivos cuya acumulación de licopeno era mayor (coloración rosada más intensa) se seleccionaban para inocular de nuevo medios suplementados con los antiobióticos correspondientes con una concentración del 1% y en presencia o ausencia de IPTG (concentración final 0.5 mM) que se dejaron crecer durante 15 horas más.
En cada caso se realizaron dos réplicas biológicas para cada condición de cultivo. Pese a la gran variabilidad que se observaba en los cultivos líquidos de la misma cepa en cuanto a la producción de licopeno, se observaba como las células sobreexpresoras de DXS llegaban a acumular entre 5 y 8 veces más licopeno en ausencia de IPTG que las células control (transformadas con el plásmido pQE-30 vacío) crecidas exactamente en las mismas condiciones (Figura 6). La sobreexpresión del enzima DXR en ausencia de IPTG producía un ligero aunque significativo incremento en la producción de licopeno en comparación con la tasa de producción de las células control, lo mismo que ocurría en el caso de HDR (Figura 6). Sin embargo, pese a un estudio reciente donde se sugería un papel regulador para los enzimas MCT y MDS en el control del flujo metabólico de la vía del MEP (Yuan et al., 2006), en nuestro estudio observamos que la sobreexpresión de los restantes enzimas de la ruta no variaba la tasa de acumulación de licopeno. Todos estos datos confirman que DXS es el principal enzima regulador de la ruta MEP en cuanto al abastacemiento de isoprenoides para las células, lo cual ya había sido sugerido en trabajos anteriores. No obstante, de nuestros datos se desprende que el control del flujo podría estar compartido con otros enzimas (DXR y HDR) aunque de forma minoritaria, igual que había sido descrito en plantas (Botella-Pavia et al., 2004; Carretero-Paulet et al., 2006).
Figura 6. Niveles de producción de licopeno de células transformadas con plásmidos con los genes codificantes para los enzimas de la ruta del MEP. Los cultivos se realizaron en medio líquido (10 ml) en presencia de IPTG 0.5 mM (barras grises) o en ausencia de IPTG (barrras blancas) a 37ºC en agitación durante 15 horas. La producción de pigmentos se representa normalizada al crecimiento celular y relativa a los niveles de células control transformados con un plásmido pQE-30 vacío. Los asteriscos indican valores significativamente distintos (T-test) a los del control.
A diferencia de lo que ocurre en sistemas vegetales, en nuestro estudio no se observa una correlación positiva entre la sobreexpresión de estos enzimas y un incremento en la producción de carotenoides. El descenso en los niveles de licopeno que vemos cuando sobreexpresamos DXS y DXR al añadir al medio IPTG pueda deberse a la disminución que se produce en las células de gliceraldehído 3-fosfato (GAP), produciéndose una inhibición en el crecimiento celular. El GAP, al igual que el piruvato, además de tratarse de un sustrato de la vía del MEP, está implicado en numerosos procesos metabólicos celulares. Una disminución de la disponibilidad de piruvato y GAP como consecuencia de la sobreexpresión de dxs puede tener efectos deletéreos en el crecimiento celular, como ya había sido descrito anteriormente (Jones et al., 2000; Kim y Keasling, 2001). Esto unido a los requerimientos energéticos que supone la sobreexpresión de un enzima que puedan afectar al metabolismo de la célula puede explicar la falta de una producción de licopeno incrementada en nuestras células. El uso de vectores de baja copia inducibles en vez de copia mútiple permitiría una precisa expresión de los genes de la ruta sin causar ningún tipo de interferencia en el crecimiento (Kim y Keasling, 2001), obteniéndose un rendimiento mayor en la producción de licopeno. Una modulación en los niveles de expresión de los genes que codifican para estos enzimas implicaría una optimización en la producción de licopeno posiblemente.
Como estrategia alternativa para aumentar los niveles de precursores isoprenoides decidimos emplear la cepa EcAB4-1 (Sauret-Gueto et al., 2006b) tranformada con el vector pLYC, lo que nos permitía aumentar los niveles de IPP y DMAPP mediante la adición exógena al medio de MVA y estudiar el efecto de la disponibilidad de precursores en la síntesis de carotenoides. Siguiendo el mismo proceso experimental que en el caso anterior, se escogieron
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aquellas tres colonias que presentaban la mayor coloración rosada para realizar los precultivos e inóculos celulares a paritr de los cuales se analizaría la producción final de licopeno. Como se esperaba, en presencia de MVA las células producían una mayor cantidad de licopeno que las células control (crecidas en ausencia de MVA) ya que al no ser éste producido por las células de forma endógena los enzimas del operón del MVA no debían de interferir negativamente con el metabolismo celular. Sin embargo, cantidades crecientes de arabinosa se correlacionaban negativamente con la producción de este pigmento. Este efecto negativo podía deberse bien a la interferencia del operón del MVA con el metabolismo celular o bien a los efectos tóxicos que podría tener el acúmulo de IPP al no poder ser canalizado para su conversión en licopeno, opción que ya había sido descrita anteriormente (Campos et al., 2001; Martin et al., 2003). Para distinguir entre ambas posibilidades se estudió la producción de licopeno a lo largo del crecimiento celular en presencia de dos cantidades de MVA (1 y 5 mM) a la concentración de arabinosa 0.1%, la cual no provocaba ningún tipo de inhibición en el crecimiento celular. A diferencia de las células control (crecidas en ausencia de MVA) que presentaban su máxima producción de licopeno en la fase exponencial, aquellas que crecían en presencia de MVA continuaban sintetizando licopeno hasta en la fase estacionaria de su crecimiento, observándose una ligera inhibición en el crecimiento celular cuando crecían en presencia de una concentración 5mM de MVA (Figura 4, Artículo 1). La correlación positiva observada entre la adición de MVA al medio y la acumulación de licopeno, además de la relación inversamente proporcional entre arbinosa y pigmento, sugerían que un exceso en los niveles de enzimas codificados por el operón podrían interferir negativamente con el metabolismo celular. También se podía deducir que un incremento en la producción de precursores podría ser eficientemente canalizado hacia la formación de productos finales. Con el propósito de analizar el nivel de acumulación máxima de licopeno que se podía alcanzar en las células EcAB4-1 durante su fase estacionaria, se añadieron cantidades crecientes de MVA (0-5-25-50 mM) al medio de cultivo, consiguiéndose con 25 mM de mVA una producción de licopeno 10 veces mayor que en ausencia de esta molécula (Figura 5, Artículo1), sugiriendo que la inhibición en el crecimiento celular observada no se debía a un exceso de IPP y DMAPP tóxicos para la célula. Sin embargo, este rendimiento no puede superarse incrementando la cantidad de MVA exógeno, ya que cuando la concentración de éste se duplicaba (50 mM) no se observaba una mejoría en la acumulación del pigmento. Estos datos sugerían la existencia de otros factores limitantes además del aporte de precursores en la producción de licopeno. Una posible explicación sería la carencia de sistemas de transporte para el MVA por parte de las células bacterianas, de modo que al entrar el MVA en la célula por simple difusión, no todo el producto añadido al medio podría ser metabolizado.
Dado que el fondo genético bacteriano puede afectar sustancialmente a la producción de carotenoides (Matthews y Wurtzel, 2000; Vadali et al., 2005; Yuan et al., 2006) el mismo planteamiento experimental se llevó a cabo en células de E. coli BL21 (DE3) a las que se les había introducido el operón del MVA por transducción con el fago P1, la cepa EcAM5-1 (Rodriguez-Villalon et al., 2008). En comparación con la producción de licopeno alcanzada por
la cepa EcAB4-1, el cambio de fondo genético provocaba una duplicación en los niveles alcanzados de pigmento (Figura 5, Artículo 1). Es posible que el fondo genético presente en las células EcAM5-1 sea más apropiado para la sobreexpresión de enzimas y proteínas recombinantes así como puede disponer de más recursos tanto energéticos como físicos (almacenamiento) para la síntesis de carotenoides. Todos estos datos sugieren que el empleo de una vía heteróloga como el operón del MVA puede incrementar la producción de licopeno a través de un incremento de los niveles de IPP y DMAPP. Estos datos concuerdan con datos ya publicados (Martin et al., 2003; Yoon et al., 2007), donde se demuestra la correlación positiva entre la incorporación de MVA y la producción de licopeno. El aumento de los niveles de sustrato de la propia vía del MVA, el acetil-CoA, bien mediante la inactivación de las vías de conversión del acetato en otros productos (Vadali et al., 2005) o bien mediante la introducción de una acetil-CoA sintasa (Shiba et al., 2007) se presenta como una estrategia útil para optimizar la producción de carotenoides, así como la combinación con la sobreexpresión del principal enzima regulador de la vía del MEP, DXS y la adición de una fuente de carbono (Yoon et al., 2007). Sin embargo, cómo mejorar la expresión de los genes heterólogos de las vías sintéticas o cómo reducir la interferencia con el metabolismo energético de las células son factores que aún hoy se desconocen.
Todos estos datos sugieren que, factores como un preciso balance en la expresión de proteínas recombinantes o la capacidad de almacenamiento han de tenerse presentes a la hora de optimizar la producción de carotenoides en bacterias modificadas genéticamente. Sin embargo, la importancia de los precursores IPP y DMAPP como factor limitante en la producción de carotenoides se confirma por los elevados niveles de licopeno producidos al introducir una vía heteróloga como el MVA o al sobreexpresar enzimas como DXS, DXR o HDR. Estos resultados se correlacionan positivamente con lo observado en plantas, donde la sobreexpresión de DXS, DXR y HDR producía un incremento en la producción de carotenoides (Carretero-Paulet et al., 2006; Botella-Pavia et al., 2004). Por otro lado, la falta de efecto de la sobreexpresión de otros genes de la ruta del MEP como HDS sobre la acumulación de carotenoides en E. coli (Figura 6) sugiere que estos enzimas tienen un papel relevante en el control del flujo metabólico de la vía. De acuerdo con esta posibilidad, la sobreexpresión de HDS en plantas de Arabidopsis thaliana no alteraba la síntesis de carotenoides (Flores-Perez et al., 2008a). Mi contribución a este trabajo (Anexo 1) consistió en la realización de las medidas de pigmentos en los cultivos bacterianos. La correlación positiva entre los datos obtenidos en Arabidopsis y células de E. coli validan el estudio de la carotenogénesis en sistemas bacterianos, un sistema mucho menos complejo que organismos superiores como las plantas.
3.1.2 Mejora de la capacidad de almacenamiento mediante la expresión de genes de