La longitud genómica de las cepas detectadas indicaba un peso molecular aproximado de 12,7 kbp, sugiriendo que se trata de CHV1. Estos resultados concuerdan con Allemann et al. (1999) ya que en Europa solamente detectaron CHV1. La doble banda observada en algunas muestras ya fue observada también estos mismos autores y sugirieron que se trataba de M-dcARN.
La amplificación de parte de la ORF-A del virus resultó en bandas de unos 1400 bp. No obstante, mediante PCR no era posible identificar el subtipo de las cepas.
Mediante RFLP se pudo observar cierta diversidad genética de C. hypovirus, aunque solamente se detectó con certeza el tipo CHV1-I. La detección de este subtipo vírico en Cataluña es importante ya que, tal y como ponen de manifiesto Heiniger y Rigling, (2009), es importante conocer el subtipo vírico
53 por las diferencias que se dan entre ellos. Por otro lado, Chen y Nuss, (1999), Lin et al. (2007) y Peever et al. (2000) reportaron importantes diferencias entre virus pertenecientes a CHV1.
El subtipo vírico claramente predominante en Cataluña era el CHV1-I. Aunque este subtipo estaba muy asociado a un patrón concreto, se obtuvieron otros patrones diferentes tanto con HaeIII como con HinfI igualmente pertenecientes a CHV1-I. Teniendo en cuenta que CHV1-I es un subtipo que se dispersa con facilidad y que se ha encontrado de manera escasa pero bastante repartida, es lógico pensar que el hipovirus está en una fase de expansión y por lo tanto es muy posible que en pocos años tenga mucha más representación en las masas de castaño.
En este estudio se detectaron patrones RFLP idénticos a algunos de los descritos por Allemann et al. (1999). Curiosamente, el patrón RFLP más observado en Cataluña es también el más frecuente de Europa, tanto el obtenido con HaeIII como con HinfI.
Además de los distintos patrones pertenecientes a CHV1-I, se observaron patrones aún no descritos. En ese sentido, se detectaron patrones especialmente interesantes por su rareza. En primer lugar, la muestra LL1437 estaba alejada de los patrones típicos de CHV1-I, presentando una banda de 500 bp., más bien propia de CHV1-F. Aún así, existe también la posibilidad que esta muestra sufriera una digestión incompleta debido a un exceso de ADN en el momento de su digestión.
Las muestras LL1168, LL1169 y LL1170 eran también especialmente interesantes por su gran similitud con CHV1-E. CHV1-E fue detectada por Allemann et al. (1999) en Navarra y es el subtipo Español. Gobbin et al. (2003) observaría una alta similitud de CHV1-E con CHV1-D, detectado en Alemania. Tal y como se observa en la figura 14, las cepas más interesantes por su rareza estaban en una zona concreta de la geografía catalana (cerca de Osor). Este hecho podría sugerir que en la zona hubo cierta actividad asociada con el transporte de material vegetal y, por lo tanto, se favoreció la entrada del hipovirus. Para la detección y corroboración de esta hipótesis sería interesante
54 realizar un segundo muestreo en la zona para detectar otros posibles subtipos o incluso tipos diferentes.
Aparte de estas muestras, se han detectado cepas con patrones que tampoco han sido descritos, aunque presenten bastante similitud con CHV1-I.
Montenegro et al. (2008) afirmaban que en España ha habido múltiples introducciones de CHV1, al detectarse en León el tipo CHV1-F y en Cataluña el CHV1-I. No obstante, tal y como muestran los resultados del presente estudio, en Cataluña también hubo múltiples introducciones incluso a nivel parcelario. Precisamente las dos parcelas con mayor porcentaje de hipovirulencia detectada (Bansells y Xocolatera) demostraron tener diversidad vírica, lo cual significaría que el virus se introdujo en estas parcelas reiteradas veces. Además, no todas las cepas detectadas en estas parcelas pertenecían a CHV1-I, aunque si presentaban patrones similares a los mostrados por este subtipo. En el caso de Bansells, todas las muestras digeridas con HaeIII mostraron una pertenencia a CHV1-I, aunque no las digeridas con HinfI. En el caso de las muestras digeridas con HinfI, casi todas las muestras presentaron un patrón al que no pertenecía ninguna otra cepa catalana. Este patrón era muy similar al patrón más representativo de Cataluña (Patrón 1 HinfI) y únicamente difiería en el peso molecular de una banda. En el caso de Xocolatera sucedió al contrario ya que el patrón obtenido con HinfI pertenecía a CHV1-I mientras que el obtenido con HaeIII aún no había sido descrito.
En la discusión de este estudio se ha sugerido que las cepas del Alt Empordà proceden de Francia, ya que Robin et al. (2000) observaron importante presencia de hipovirulencia en Languedoc-Rousillon, zona cercana a el Alt Empordà. Por otro lado, Allemann et al. (1999) observaron diversidad de CHV1-I en Francia. En este estudio se pudo observar como muchos de los patrones RFLP observados en las cepas del Alt Empordà fueron también detectados por Allemann et al. (1999) en Francia, lo cual sugiere que la hipovirulencia del Alt Empordà pudo provenir de Francia o viceversa.
55 Las dificultades por describir las nuevas cepas detectadas se deben en parte a que los patrones obtenidos por HaeIII tenian pesos moleculares muy pequeños (de hasta 105 bp.). Además, las bandas obtenidas acostumbraban a presentarse muy juntas, lo cual dificultaba una buena visualización de las distintas bandas y obligaba a tener una buena cantidad de producto PCR para una buena visualización posterior de los patrones en gel de agarosa. Por otro lado, mediante gel de agarosa era imposible describir exactamente el peso de las bandas sino que ara ello se debe utilizar un gel de poliacrilamida.
El estudio genético mediante RFLP de C. hypovirus no aseguró por completo la pertenencia a los subtipos comentados en este estudio, aunque si fué una muy buena aproximación. Para afirmar con certeza el subtipo al que pertenecían y para conocer el nivel de similitud o lejanía de las cepas con los prototipos CHV1-EP713 y CHV1-Euro7, se debería utilizar la técnica de secuenciación de la ORF-A, tal y como hicieron Gobbin et al. (2003) y Montenegro et al. (2008). Asimismo, realizar esta técnica sería especialmente interesante en aquellas muestras detectadas en este estudio y que sus patrones RFLP aún no han sido descritos.
En este estudio no se pudieron amplificar 4 muestras. Para solucionar este problema, se realizaron varios intentos de amplificación retocando parámetros del protocolo. Primeramente se incrementaron los ciclos de la PCR y se disminuyó la temperatura de alineamiento a 55ºC. En el segundo intento, se partió de una mayor cantidad de dcARN. En el tercer intento, se partió de una mayor cantidad de cADN. En el cuarto intento se realizó todo el proceso partiendo de una nueva extracción del dcARN de la muestra. Finalmente, a pesar de las diversas modificaciones no se pudieron amplificar estas muestras. Puede haber diversos motivos que expliquen este fenómeno. En primer lugar, podría ser que se partiera de una muestra excesivamente contaminada por RNAsas o bien con pequeñas porciones de otros inhibidores o contaminantes. En segundo lugar, podría ser que los iniciadores no fueran capaces de detectar
56 la diana por tratarse de muestras pertenecientes a otro tipo vírico. Para contrastar estas hipótesis, sería interesante desarrollar nuevos intentos de amplificación o bien utilizar otras técnicas moleculares que permitan conocer el tipo vírico.