REASONING SYSTEM AND ALGORITHM

La PCR fue desarrollada en 1986 por el científico Kary Mullis, es una de las técnicas más importantes de la biología molecular y gracias a ella se han obtenido muchos avances en la biotecnología (entre ellos secuenciación y clonación). Este método amplifica una región selectiva del ADN, es decir, permite obtener muchas copias de ese fragmento simulando el proceso de replicación que se da en las células naturalmente. La técnica depende de la capacidad del ADN para desnaturalizarse e hibridar con alineadores o primers que sirven como cebadores para que la enzima Taq polimerasa (una enzima termoestable aislada del microorganismo Termus aquaticus) sintetice una nueva hebra de ADN usando una cadena de ADN como molde. Para realizar la PCR no se necesita conocer la secuencia del ADN a amplificar pero si los bordes que flanquean el ADN de interés, indispensable ésto para el diseño de los primers o cebadores (figura 55).

Figura 55. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Tomado del enlace: http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa tiene varios componentes que permiten obtener muchas copias de una región del ADN, todos ellos deben estar presentes en el tubo de reacción para que tener una amplificación exitosa. Se realiza en un equipo llamado termociclador. Los componentes son:

82  ADN molde

Contiene la región del ADN que se quiere amplificar, se puede usar segmentos de ADN o incluso genomas completos.

 Desoxirribonucleosidos-trifosfato (dNTP)

Son los nucleótidos que componen el ADN (adenina, timina, guanina y citosina) y los que la enzima DNA polimerasa (taq polimerasa) usará para polimerizar y sintetizar nuevas copias de ADN.

 Cebadores o iniciadores (primers en inglés)

Son fragmentos u oligonucleótidos complementarios a cada cadena del ADN molde, los cuales apuntan entre si en direcciones opuestas. Flanquean la región a amplificar. Usualmente se usan primers de 17-20 nucleótidos (merts). El uso de primers muy pequeños o grandes genera limitantes para la PCR.

 Iones

Usualmente se usan el ión de magnesio divalente (MgCl2) ya que este actúa como

cofactor de la enzima DNA polimerasa (taq polimerasa) para aumentar su procesividad.  Buffer

Es una solución que mantiene el pH adecuado para la actividad de la enzima y amplificación del ADN.

 DNA polimerasa

Usualmente se emplea la taq polimerasa, es la enzima que se encarga de unir los dNTPs al ADN molde para sintetizar una nueva cadena de ADN que a su vez servirá como molde.

La PCR se desarrolla básicamente en tres etapas que se repiten aproximadamente 30 veces, llamados ciclos. Estas son:

 Desnaturalización

La molécula de ADN molde se desnaturaliza (separación de las cadenas) a altas temperaturas (usualmente a 94- 95 °C). Ver círculo 1 de la figura 55.

83  Alineación

La mezcla de reacción se enfría a 50-60 °C para que se de la hibridación o unión de los cebadores o primers a su secuencia complementaria (alineación). Círculo 2 de la figura 55.

 Extensión

De nuevo se aumenta la temperatura (usualmente a 47 °C) para que la enzima Taq polimerasa sintetice una nueva cadena de ADN usando los dNTP. Círculo 3 de la figura 55.

Luego de la primera extensión o elongación se vuelve al repetir de nuevo el ciclo de desnaturalización de tal manera que la cadenas de DNA nuevas puedan servir como molde para generar nuevo ADN (círculo 4 de la figura 55). Los tres ciclos se repiten aproximadamente 30 veces así que se obtienen millones de fragmentos del ADN que se quería amplificar.

Los productos de PCR pueden tener varias finalidades: gel de electroforesis, clonación o secuenciación. Todas estas técnicas son indispensables para el desarrollo de microorganismos recombinantes que tengan características especiales como degradación de contaminantes ambientales, transgénicos, resistentes, etc.

Electroforesis en gel

Permite separar moléculas a través de una matriz porosa (gel de agarosa o poliacrilamida) donde la muestra (ácidos nucleicos o proteínas) migra por un campo eléctrico con base a su carga, forma, masa o tamaño. Después de terminado el corrido las muestras menos pesadas migrarán más rápido y quedarán en la parte de abajo del gel mientras que las más grandes en la parte superior. Para conocer el tamaño se usan marcadores de peso molecular conocido y programas informáticos. Comúnmente los fragmentos se pueden observar con tinciones del ADN (bromuro de etidio, con la ayuda de una cámara de luz U.V) o proteínas (con colorantes como el azul de Coomassie) (figura 56).

84 Figura 56. Electroforesis de proteínas y gel de corrido. A la izquierda electroforesis en gel de poliacrilamida de proteínas (lipasas) y a la derecha corrido electroforético de producto de PCR. Fuente Carmen Julia Pedroza.

Secuenciación de ADN

Es una técnica que permite conocer el orden exacto de los nucleótidos en una muestra de ADN (ADN genómico, mitocondrial o de cloroplastos, producto de PCR, plásmidos, etc); existen varios métodos para la secuenciación, entre ellos el método de terminación en cadena o el de degradación química.

Clonación

La clonación permite obtener muchas copias de un gen determinado, por ejemplo, se quiere estudiar un producto de PCR éste se puede introducir con la ayuda de enzimas de restricción a un vector (plásmido o fago) para obtener muchas copias del gen de interés el cual puede tener alguna característica especial (como la producción de proteínas o resistencia). Esta información genética puede llevarse hasta organismos vivos pero son varios los procedimientos que se realizan para lograr transformaciones o expresiones génicas.

NOTA:Leer la sección 10.14 en el libro: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003).Brock

biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall.

Los fundamentos de técnicas como Southern y Northern blot y RFLP aparecen en este enlace:

http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/mbglossary/mbgloss.html

y leer temas relacionados en los libros de Lodish o Brown (ver la bibliografía del módulo para mayor detalle.

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