personality disorder
1.2 Recognition and management in primary care
Como fue demostrado en los trabajo seminales de Saupe[17] y Samulski,[41] el uso de un medio
externo previamente orientado por medio de los mecanismos físicos ya referidos puede inducir alineamiento tanto en el disolvente empleado como en otras moléculas en disolución. Para explicar el mecanismo de alineamiento suele considerarse que el medio consiste en cavidades en las que la molécula de soluto está confinada y no puede explorar todas las orientaciones con igual probabilidad. Para que este mecanismo sea efectivo, estas cavidades deben ser pequeñas, de tamaño comparable a la molécula. Además del efecto estérico hay que tener en cuenta el potencial electrostático y la posibilidad de interacciones entre el soluto y el medio de alineamiento. Los sistemas más utilizados son los cristales líquidos y los geles poliméricos comprimidos, que se describen a continuación.
Cristales líquidos
El comportamiento de un cristal líquido puede describirse como un fenómeno supramolecular basado en la existencia de interacciones intermoleculares débiles del tipo dipolo-dipolo o fuerzas de dispersión. Para que estas interacciones sean suficientemente importantes, generalmente es necesario que las moléculas tengan formas anisótropas, lo que da lugar a un empaquetamiento eficaz. De este modo, estas interacciones son suficientemente fuertes para mantener las asociaciones entre moléculas en una orientación preferente, sin pérdida de
libertad de movimiento, teniendo en cuenta que no se encuentran unidas por enlaces covalentes. Los complejos con comportamiento de cristal líquido suelen ser moléculas grandes y alargadas. Esta forma alargada hace que las moléculas se coloquen paralelamente y que al mismo tiempo tengan la libertad de desplazarse unas respecto a otras a lo largo de sus ejes.
Según sea ladisposición de sus moléculas, los cristales líquidos dan lugar a tres tipos de fases: • En la fase nemática las moléculas están situadas en la misma dirección, pero algunas
de ellas de forma no totalmente paralela, sino con una cierta desviación. • En la fase esméctica las moléculas se encuentran alineadas y formando capas.
• En la fase colestérica las moléculas forman capas parecidas a las de la fase esméctica, pero con la diferencia que las moléculas de las capas vecinas se disponen con ángulos diferentes, dando al cristal líquido una disposición helicoidal.
Los cristales líquidos se pueden clasificar también según su modo de preparación. Aquellos que se forman por fusión de la fase sólida se denominan cristales líquidos termotrópicos y aquellos que se forman al destruir la red cristalina del compuesto por adición de un disolvente se denominan cristales líquidos liotrópicos. Estos últimos presentan una dificultad en su preparación porque la proporción entre el mesógeno y el disolvente es crítica, pudiendo resultar en un gel isótropo o anisótropo según los casos. Por ejemplo, con PELG/CDCl3 y
PBLG/CDCl3 (Figura 0.11) se ha comprobado que cuanto más largo sea el polipéptido más
bajo será el grado de orientación.[14] El aumento en el peso molecular del mesógeno permite
reducir al mínimo la concentración necesaria para obtener una única fase líquida cristalina, disminuyendo así el poder de alineamiento de la fase.
Los cristales líquidos más usados son los liotrópicos, ya que los termotrópicos proporcionan grados de alineamiento demasiado fuertes, haciendo casi imposible la extracción de los RDC.
[18]
Figura 0.11: Tubos de RMN de 5 mm que contienen PBLG como sólido blanco (izquierda) y PBLG/CDCl3 en fase líquida cristalina (derecha).[13]
Las primeras fases liotrópicas empleadas para medir RDC fueron acuosas, muchas de ellas de naturaleza bicelar[15, 42] o basadas en bacteriófagos.[43, 44] Otros sistemas populares son las fases
de Helfrich, que consisten en mezclas de cloruro de cetilpiridinio (CPCL), n-hexanol y NaCl acuoso. Aunque esta fase fue diseñada para alinear proteínas, también se ha empleado para el alineamiento de carbohidratos[45, 46] y del hidrocloruro de la isoquinolina salsolidina.[47]
Los ejemplos de fases liotrópicas compatibles con disolventes orgánicos para RMN, como el CDCl3, son más escasos. Los más empleados han sido disoluciones de homopolipéptidos[48],
como poli-γ-bencil-L-glutamato (PBLG) o su enantiómero PDBG,[49, 50]poli-γ-etil-L-glutamato
(PELG, Figura 0.12), o poli-ε-carbobenciloxi-L-lisina (PCBLL).[51] Estas fases se han usado
para alinear diversas moléculas orgánicas pequeñas, principalemnte en CDCl3, aunque
también son compatibles con otros disolventes. Estos homopolímeros adoptan una estructura helicoidal en disolución a consecuencia de la anisotropía magnéticas de sus monómeros constituyentes. Aunque provocan un grado de alineamiento menor que los cristales líquidos liotrópicos, el alineamiento es aún algo elevado pues se necesita una concentración mínima o umbral de polipéptido que, típicamente, induce un acoplamiento cuadrupolar del CDCl3 de
varios cientos Hz y valores de 1D
CH RDC del orden de 102 Hz. En condiciones similares, el
PELG presenta un grado de orden menor que el PBLG, siendo por tanto mejor elección como cristal líquido.
La quiralidad inherente al PBLG y PELG puede inducir un alineamiento ligeramente diferente para los enantiómeros de una molécula.[52] No obstante, las diferencias de RDC entre los
enantiómeros son tan pequeñas que no permiten discriminarlos. Sí que se han utilizado para la discriminación quiral de sustratos deuterados mediante medidas del acoplamiento cuadrupolar de deuterio, que es aproximadamente un orden de magnitud mayor que los acoplamientos
1D
CH en las mismas condiciones de alineamiento.
En los últimos años se han publicado otros sistemas basados en polímeros liotrópicos helicoidales como pueden ser las fases de beta-péptidos.[53] Los polímeros de poliguanidina[54]
presentan propiedades de alineamiento aún más fuerte que los poliglutamatos. Otras fases propuestas recientemente son poliisocianatos[55] y poliacetilenos. Estos últimos dan espectros
con señales estrechas y se han usado para la discriminación enantiomérica.[56]
Figura 0.12: Estructura química del PELG y PBLG.[57]
Geles constreñidos
Los geles poliméricos estirados fueron introducidos por Deloche y Samulski en 1981.[41] Con
posterioridad, los geles tensionados (SAG, strained aligning gels) fueron propuestos por Ishii et al.[58], y por Grzesiek et al.[59] para la medida de RDC de proteínas. El primer ejemplo de un
gel polimérico compatible con un disolvente orgánico, y por tanto adecuado para el estudio de moléculas pequeñas, fue presentado por Luy et al. en 2004[60], demostrando que las moléculas
pequeñas pueden alinearse usando disolventes orgánicos en geles de poliestireno (PS). Con posterioridad se ha desarrollado un método sencillo para utilizar geles comprimidos en lugar de estirados.[61]
Figura 0.13: Representación esquemática de los medios de alineamiento. El cristal líquido (representado por cilindros oscuros) deja cavidades ocupadas por la disolución, representada en gris claro. En los geles poliméricos (método SAG), las cavidades son más alargadas, en promedio, en dirección axial o radial según sean las fuerzas de compresión o resistencia que experimente el gel.
El procedimiento para alinear moléculas con un gel polimérico entrecruzado consiste en introducir un pequeño cilindro de polímero seco en el fondo de un tubo de RMN. Al añadir el disolvente (por ejemplo CDCl3), el polímero absorbe disolvente hinchándose en todas
direcciones. Una vez que el gel alcanza las paredes del tubo, el gel deja de crecer en dirección radial pero sigue hinchándose en dirección axial, la única que puede, creando cavidades más o menos alargadas (anisótropas) que favorecen la orientación del disolvente y de la molécula en estudio.
Figura 0.14: Demostración del método SAG con un gel de poliestireno entrecruzado. Izquierda: tubo de RMN que contiene el fragmento del polímero seco. Centro izquierda: fragmento de polímero seco fuera del tubo. Centro derecha: polímero que se ha hinchado libremente hasta su diámetro original. Derecha: polímero hinchado dentro de un tubo de RMN, donde se aprecia que ha crecido mucho más en la dirección axial que en la radial.[13]
En los últimos años se han publicado medios de alineamiento compatibles con disolventes orgánicos como el polidimetilsiloxano (PDMS, Figura 0.15),[62] poli(acetato de vinilo)
(PVAc),[63] poliacrilonitrilo (PAN),[64] y polimetacrilato de metilo (PMMA, Figura 0.16).[65]
La introducción de medios de alineamiento compatibles con agua se hacía muy necesaria para poder sacar el máximo partido de los RDC en la determinación estructural de moléculas solubles en agua, como productos naturales y compuestos bioactivos. Como ejemplo el gel “gummibärchen” (ositos de goma) presentado como un medio de alineamiento quiral[66] o el
gel PH[67], que es un gel copolimérico entrecuzado de poliacrilamida-AMPS. Este último, además, fue el primer medio de alineamiento compatible con DMSO y puede alinear moléculas pequeñas en agua mucho mejor que los geles de poliacrilamida puros.
Figura 0.15: Estructura química del polímero PDMS..[62]
Tanto los geles poliméricos entrecruzados de poliestireno como los basados en acrilamida usan el principio SAG (strained aligning gel), en el que el polímero se sintetiza en una cámara de diámetro igual o mayor que la de un tubo de RMN. Después de la polimerización, el disolvente se elimina y se seca. Se obtiene de este modo un fragmento seco de forma más o menos cilíndrica, que se coloca en el fondo de un tubo de RMN, donde se hinchará al añadirle un disolvente. En promedio, la elongación de las cavidades será a lo largo del eje principal (sistema uniaxialmente anisótropo), que es colineal con el campo magnético externo B0.
No obstante, la dirección del alineamiento (relativa a B0) se puede cambiar mecánicamente
comprimiendo el gel en vez de estirarlo.[61] Para ello se emplea un pistón cuya presión puede
regularse manualmente (Figura 0.17). Con este método, el grado de alineamiento es independiente de la intensidad del campo, y puede ser modulado modificando las condiciones de hinchado (disolventes o aditivos) o modificando la composición del polímero (proporción del agente entrecruzante o las dimensiones del molde). La posibilidad de controlar el grado de alineamiento y la dirección es una de las principales ventajas del método SAG.
Figura 0.16: Estructura química de los polímeros PS[41, 68], PVAc[63], PAN[64] y PMMA[65, 67]
En la Tabla 0.1, se muestra un resumen de los medios de alineamiento más empleados para moléculas orgánicas. Se incluyen cristales líquidos liotrópicos y geles poliméricos, indicando su compatibilidad con medios acuosos y orgánicos.
Tabla 0.1: Medios de alineamiento más destacados para moléculas pequeñas y su compatibilidad con los disolventes.
Medios de alineamiento Disolventes compatibles
Cristales líquidos bicelas, micelas[15] D 2O fases de Otting[69] D 2O CPCL/hexanol[47] D 2O PBLG[49] CDCl 3, CD2Cl2, DMF, THF, dioxano PELG[57] CDCl 3, CD2Cl2 Polímeros entrecruzados Gelatina[66] D 2O Polyacrylamide[59] (PAA) D 2O
Polylacrilamide co-polymers[67] (PH-gel) D
2O, DMSO, DMF
Poly (acrylonitrile)[64] (PAN) DMSO, DMF
Poly (vinyl acetate)[63] (PVAc) CDCl
3, CD2Cl2, CD3OD, CD3CN, DMSO, DMF, C6D6,
acetona Poly (methyl methacrylate)[65] (PMMA) CDCl
3, CD2Cl2, CD3CN, acetona, C6D6, AcOEt
Polystyrene (PS)[70], deuterated (dPS) CDCl
3, CD2Cl2, THF, C6D6, dioxano
Un condicionamiento para elegir un medio de alineamiento es que las resonancias del propio medio no interfieran con las señales del compuesto bajo estudio. Los cristales líquidos presentan fuertes alineamientos, por lo que sus señales de protón no suelen aparecer en el espectro debido al gran ensanchamiento causado por la multitud de acoplamientos dipolares homonucleares. En los geles poliméricos, algunas señales residuales del polímero son detectables y pueden solaparse con las del compuesto analizado. Estas señales residuales pueden suprimirse con un filtro de relajación en la secuencia de pulsos o preparando el polímero deuterado.[71]
Gel compresible de PMMA
El gel de PMMA/CDCl3 fue desarrollado por Gil et al.[65, 67] y posee unas características que le
convierte en una buena opción a la hora de medir RDC. Se explican aquí sus propiedades ya que se ha usado en parte del trabajo presentado en esta tesis. El polímero PMMA [poly (methyl methacrylate)] es barato y fácil de preparar, su esqueleto central es un polímero rígido y la ausencia de anillos aromáticos minimiza la posible perturbación del desplazamiento químico de los solutos. La rigidez del polímero provoca una rápida relajación transversal de sus protones, reduciendo al mínimo las resonancias residuales del gel que pudieran solaparse con las resonancias del soluto. Sus propiedades mecánicas lo hacen muy adecuado para ser comprimido con un pistón, siendo el proceso de compresión y relajación del gel totalmente reversible, por lo que se puede variar el grado de orden del gel en función del valor de los RDC.
El procedimiento usual para hinchar un gel de PMMA sigue el principio SAG. Se coloca un fragmento del polímero seco de aproximadamente (longitud L ≈ 10 mm) en un tubo de RMN y se le añaden 600 μL de CDCl3. La expansión longitudinal del gel se controla con un émbolo
que hace presión contra el gel. El gel se hincha hasta ocupar la cavidad en unas horas (Figura 0.17). Al cabo de este tiempo se mide el acoplamiento cuadrupolar del disolvente para
comprobar que el gel está orientado. Antes de añadirle el compuesto, se deben limpiar los restos de monómero que pudieran quedar en el gel haciendo varios lavados con CDCl3. Para
ello se bombea con émbolo intercambiando el disolvente varias veces hasta que el espectro de protón se vea limpio. Después se añade el soluto disuelto en CDCl3 y se vuelve a colocar el
émbolo. A continuación se miden los espectros de RMN necesarios para extraer los RDC. El grado de alineamiento se controla en función de la presión que ejerza el émbolo contra el gel. El grado de orientación de las moléculas aumenta con el grado de compresión. Finalmente, el mismo procedimiento de lavado puede emplearse para recuperar la muestra analizada, lo que permite que un mismo gel se pueda emplear para otras medidas.
Figura 0.17: Representación del gel de PMMA con CDCl3 para diferentes grados de compresión. (A) Se
introduce en el tubo de RMN el fragmento de PMMA seco y el CDCl3 para que el gel se hinche bajo la
presión de un émbolo. (B) Grado de compresión y orientación inicial. El PMMA está hinchado y con el émbolo en su posición de máxima compresión axial, con lo que el grado de orientación molecular es máximo. (C) Grado de compresión y orientación intermedio. (D) El gel de PMMA se encuentra totalmente relajado, sin compresión axial del pistón y el grado de alineamiento es nulo.[72]