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1.3.2.1 Reconocimiento del receptor e Internalización del genoma de T7.

El fago T7 presenta un ciclo lítico y libera, en condiciones óptimas, más de 100 fagos progenie por célula en aproximadamente 25 minutos. Infecta e cepas rough de E. coli (B, C, y K-12), de Shigella spp. y d y de S. entérica (Lindberg 1973, Casjens y Molineux 2 2012). Las fibras se unen al receptor bacteriano por s su región C-terminal, aunque todavía se desconoce el

m mecanismo de dicha interacción a nivel molecular (G (Garcia-Doval y van Raaij 2012). Las fibras presentan 2

r regiones, proximal y distal, en función de su proxi- m midad al conducto de la cola (Fig 1.12) Recientemente

H Hu y colaboradores han demostrado mediante o tomografía electrónica que, a consecuencia de la

adsorción irreversible, las fibras cambian su orientación. En las partículas infectivas, las regiones distales se disponen alrededor de la cabeza, en contacto con la cápsida. Tras la adsorción irreversible, las regiones proximales adoptan una orientación meridional y las distales se orientan hacia la membrana externa, con la que tienen un contacto directo (Hu et al. 2013). Además, en las reconstrucciones tomográficas de los fagos que han eyectado su genoma presentadas por Hu, el

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complejo del núcleo proteico ya no se observa en la cabeza viral y por contra, aparece una masa extra asociada a la cola que conecta las membranas interna y externa de la envuelta (Fig.1.13). Hu y colaboradores proponen que dicha masa corresponde al complejo proteico del interior de la cabeza. Tras la adsorción irreversible, se abre el canal central que va desde la cola hasta el interior de la cabeza. Las proteínas del núcleo se translocarían entonces a través de dicho canal junto con el ADN. Una vez llegasen a la envuelta, formarían un canal que conectaría ambas membranas por donde el ADN se introduciría en el citoplasma bacteriano de forma segura. Esta hipótesis se ve apoyada por el hecho de que la proteína gp16 del núcleo presenta actividad transglicosilasa que le permite hidrolizar el peptidoglicano de la pared (Moak y Molineux, 2001) .

Por otra parte, experimentos con mutantes de T7 sensibles a supresor (ambar) han permitido detectar otras proteínas minoritarias (gp6.7 y gp7.3) relacionadas con la infección (Roeder y Sadowski, 1977), de forma que delecciones en estas proteínas disminuyen notablemente la adsorción de los mutantes de T7 a la superficie de E. coli (Kemp et al., 2005).

Además de lo ya mencionado, en la internalización in vivo del genoma de T7 participan más elementos. Se ha descrito que la translocación del genoma no es un proceso continuo, sino que se produce a saltos que vienen marcados por la propia secuencia del ADN viral. El primer segmento en internalizarse y ser transcrito por la ARN polimerasa bacteriana sería aquél de 850 pb retenido en el canal de la cola de las partículas infectivas. La polimerasa actúa como un motor, de modo que iría translocando el ADN hacia el citoplasma a medida que realiza la transcripción. Entre las proteínas tempranas que se expresan se encuentra la ARN polimerasa de T7, que realiza la translocación y transcripción del 80% de genoma restante. El proceso global tiene una duración de 10 minutos a 30ºC y requiere que haya una diferencia de potencial en la membrana citoplasmática (Molineux 2001).

Figura 1.13: Complejo de adsorción del fago T7. Se muestra la sección central (A) y el modelo 3D (B)

resultante de promediar subvolúmenes de 3352 fagos T7 asociados a la membrana. En C) se presenta la sección central y en D) el modelo 3D resultado de promediar subvolúmenes de 1886 partículas que se han adsorbido de manera irreversible. Las fibras se unen a la membrana externa, así como el conducto de la cola, que provoca una pequeña invaginación en la membrana. Las proteínas del núcleo interno de la cabeza podrían haberse eyectado junto con el ADN viral para formar un canal que extendería la cola hasta el citoplasma.

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1.3.2.2 Morfogénesis de las partículas virales

Tras la internalización del genoma, se expresan los genes tempranos para la infección y para la replicación del genoma viral. A continuación se expresan los genes tardíos, que codifican para las proteínas estructurales del virión. La ruta de ensamblaje del fago T7 se corresponde con la ruta general de los bacteriófagos con cola (Fig.1.14). Primero se forma una partícula precursora a partir de la proteína de la cápsida, el conector, la proteína de andamiaje gp9 y las proteínas del núcleo interno gp14, gp15 y gp16. Después las proteínas de andamiaje se disocian de la precabeza y el complejo terminasa se acopla temporalmente al conector para translocar activamente el ADN al interior de la precabeza. Entonces, las paredes de la cápsida se expanden y adelgazan, finalizando la maduración de la cabeza (Cerritelli et al. 2003; Ionel et al., 2010). El núcleo proteico también experimenta cambios conformacionales durante la maduración hacia cabeza madura (Agirrezabala et al., 2007). Además de intervenir en la internalización del genoma, podría estabilizar el ADN del interior de la cabeza, ya que mutantes defectivos en las proteínas del núcleo interno no dan partículas maduras estables (Serwer 1976).

Las proteínas de la cola se ensamblan de forma secuencial a las cápsidas maduras. Primero, el adaptador formado por gp11 se une al conector cerrando el canal y evitando así la salida de la molécula de ADN del interior de la cápsida, impulsada por la elevada presión a la que está sometida. A continuación se ensamblan 6 copias de gp12 al adaptador, formando el tubo central. Por último, seis fibras compuestas por gp17 se asocian al complejo de la cola (Cuervo et al. 2013). Una vez formadas las partículas infectivas, tiene lugar la lisis de la bacteria hospedadora y la liberación de las partículas infectivas para empezar un nuevo ciclo.

Figura 1. 14: Ruta de ensamblaje de las partículas virales del fago T7. Figura adaptada de (Cerritelli et

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