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interacción observada entre NapB y KapA. Para ello, se generó un fragmento de NapB que carecía de los últimos siete residuos (PRKKAKV). Mediante técnicas de PCR se amplificó una región de la secuencia codificante de napB con la pareja de oligonucleótidos Nap1 y NapB∆nls (ver tabla 2) y se introdujo en el plásmido pGEX-2T para poder expresar la proteína NapB truncada fusionada a GST.

En el experimento de interacción se utilizó matriz de IgG-sefarosa que fue incubada con extractos de proteínas expresadas en E. coli. El extracto de proteínas de la cepa de E. coli que expresó ZZ::KapA50 _{fue incubado con extractos en los que se había}

sobreexpresado GST, GST::NapB o GST::NapB∆nls, respectivamente (Fig. II.19B). Como se muestra en la figura II.19C en la matriz de IgG-sefarosa quedó retenida la Importina α así como la forma GST::NapB (línea 2), pero no la versión truncada de NapB que carecía de la putativa NLS (línea 3). Como control negativo se utilizó un extracto del polipéptido ZZ que fue incubado con la misma cantidad de extracto de GST, GST::NapB y GST::NapB∆nls que el extracto de ZZ::KapA50 _{(líneas 4, 5 y 6)}

Estos resultados muestran que la interacción entre NapB y la Importina α se produce a través de la putativa NLS monopartita de NapB.

4.2.4. NapB y la ciclina NimE compiten in vitro por la unión con la Importina α.

Los miembros de la familia Nap/SET han sido previamente descritos como proteínas capaces de interaccionar con ciclinas tipo B 168,174. Este hecho hizo pensar en la posibilidad de que una de las funciones de NapB pudiera ser la de ayudar a la Importina α a llevar a cabo la importación nuclear de dichas ciclinas. En A. nidulans se ha caracterizado sólo una ciclina tipo B y ha sido denominada NimE 175. Con el fin de verificar esta hipótesis se decidió estudiar la posible interacción entre NimE y KapA así como entre NimE y las proteínas Naps.

Figura II.20: KapA interacciona in vitro con NimE. A) Matriz de IgG sefarosa precargada

con ZZ (línea 1) o ZZ::KapA50 (línea 2 a 4), fue incubada con proteína NimE expresada in vitro y se analizó el efecto de la adición de GST::NapA (línea 3) o GST::NapB (línea 4) en la interacción de NimE con KapA. Los porcentajes indican la intensidad de la banda correspondiente a NimE, considerando el 100% la intensidad de banda observada en la línea 2. En la parte inferior se muestra el gel teñido con Coomasie. B) NapB y NimE compiten por la unión a KapA. Para comprobar el efecto de NapB en la interacción de NimE con KapA se añadieron 20µl y 100µl de extracto de células de E. coli que expresaban GST::NapB a la mezcla de reacción. En la parte inferior del gel se muestran los porcentajes de la intensidad de banda de NimE. C) Experimento de “pull-down” en el que una matriz de Glutation sefarosa precargada con GST::NapB fue incubada con extracto de ZZ::KapA50 y proteína NimE expresada in vitro (línea 1). La línea 2 corresponde a 1/3 de la cantidad de proteína NimE utilizada. En la parte inferior se muestra el gel teñido con Coomasie.

La ciclina NimE fue expresada in vitro mediante el sistema de TNT. Para ello su cDNA fue introducido en el plásmido pC20, una versión modificada del plásmido pET- 19b (Novagen) que carece del epítopo de 10 histidinas y permite expresar proteínas in vitro. Para analizar la posible interacción entre la Importina α y la ciclina B, la proteína NimE radiactiva fue incubada con una matriz de IgG-sefarosa precargada con ZZ::KapA50 o con ZZ. Como se muestra en la figura II.20A, NimE fue retenida por ZZ::KapA50 a pesar de que en su secuencia de aminoácidos no es posible identificar ninguna NLS clásica. Sin embargo, no se detectó interacción en experimentos de “pull- down” entre NimE y las proteínas GST::NapA y GST::NapB, resultados que contrastaban con los descritos previamente en otros organismos. A pesar de la falta de interacción directa entre NapB y NimE era aún posible que NapB tuviera un papel positivo en la importación nuclear de NimE llevada a cabo por KapA. Debido a ello, se decidió realizar un experimento de “pull-down” entre ZZ::KapA50 _{y NimE en presencia}

de GST::NapB o de GST::NapA. La presencia de NapA no causó ningún efecto en la interacción KapA-NimE, sin embargo, la presencia de GST::NapB en el experimento de “pull-down” provocó una disminución en la cantidad de proteína NimE retenida por ZZ::KapA50 (comparar en Fig. II.20A, líneas 3 y 4). Estos resultados sugerían que, in vitro, ni NapA ni NapB ayudaban a formar un complejo entre KapA y NimE, sino que NimE y NapB competían por la unión con KapA. Para confirmar los resultados obtenidos se realizaron experimentos de “pull-down” en los que se añadieron cantidades crecientes de la proteína de fusión GST::NapB observándose que cuanto mayor era la concentración de NapB menor era la cantidad de NimE retenida por ZZ::KapA50 (Fig. II.20B). Adicionalmente se realizó un experimento de “pull-down” en el que una matriz de glutation-sefarosa cargada con GST::NapB fue incubada con una mezcla de NimE radiactiva y ZZ::KapA50. En este experimento quedó retenida la proteína de fusión ZZ::KapA50 pero no NimE (Fig. II.20C), lo que confirmaba la falta de formación in vitro de un complejo heterotrimérico NapB-KapA-NimE.

El conjunto de estos resultados pone de manifiesto que la ciclina tipo B NimE es otro cargo putativo de KapA y que las proteínas tipo Nap/SET de A. nidulans no son capaces de interaccionar in vitro con dicha ciclina así como de ayudar a la Importina α en el reconocimiento y/o unión de NimE. De hecho, se concluye que la interacción entre KapA y las proteínas NimE y NapB debe ocurrir a través de sus respectivas NLSs y las

regiones en la importina que se precisan para ello, o que NimE interaccione con una región en la Importina α próxima al dominio de interacción con las NLSs.

Figura II.21: Localización subcelular de NapB. A) NapB::GFP muestra una localización

nuclear en interfase (GFP). Los núcleos se visualizan mediante tinción con DAPI. B) La proteína GFP::NapB expresada en levadura mostró una localización citoplásmica y vacuolar.

4.2.5. NapB es nuclear en interfase y citoplásmica durante mitosis.

Dada la ya demostrada interacción entre NapB y la Importina α se decidió continuar el estudio de esta proteína de la familia Nap/SET analizando su localización subcelular. Para ello se generó una cepa que expresaba la proteína quimérica NapB::GFP. Siguiendo el protocolo de Yang et al. 67 se generó, mediante PCR de fusión, una construcción napB::gfp::pyrGA.fum _{con la que se transformó la cepa}

MAD1425, portadora de la mutación pyrG89 y, por tanto, auxótrofa para pirimidina. Los transformantes obtenidos fueron analizados por Southern-blot para comprobar que se había producido el correcto reemplazamiento del locus silvestre por la construcción generada. El análisis con el microscopio de epifluorescencia de los transformantes

reveló que la proteína NapB::GFP se localizaba mayoritariamente en el interior del núcleo (Fig. II.21A).

En trabajos anteriores realizados en el laboratorio se había utilizado S. cerevisiae como organismo modelo para demostrar el papel fisiológico de la Importina α en el transporte nuclear de dos proteínas de A. nidulans, PacC y VeA 62,176. Para conocer si la Importina α de S. cerevisiae, Srp1p, era capaz de llevar a cabo la importación nuclear de NapB, la cepa silvestre W303-1a fue transformada con un plásmido centromérico que expresaba la proteína GFP::NapB bajo el control del promotor ADH1. A pesar de la localización nuclear observada para la proteína Vps75p etiquetada con GFP 102, la proteína GFP::NapB no se localizó en el núcleo en S. cerevisiae (Fig. II.21B). Este hecho no es aislado dado que se ha comprobado en el laboratorio que la NLS localizada en el dedo de zinc de PacC tampoco es funcional en S. cerevisiae 62_{. Por lo tanto una}

posible explicación de los anteriores resultados podría ser la falta de funcionalidad de la NLS de NapB en la levadura. Además, la falta de interacción entre el homólogo de Kap114p, KapG, y NapB o NapA, ponen de manifiesto que deben existir importantes diferencias en los mecanismos implicados en el transporte de estas proteínas en A. nidulans y S. cerevisiae.

Una vez determinada la localización subcelular de NapB en núcleos interfásicos de Aspergillus, era interesante abordar el estudio de la localización subcelular de esta proteína durante mitosis dada su posible relación con la organización de la cromatina. Como se observa en la figura II.22 y en el vídeo 9 asociado a ella, al inicio de la mitosis se produjo una disminución en los niveles de fluorescencia nuclear lo que indicaba que parte de la proteína estaba saliendo del nucleoplasma al citoplasma. Una vez terminada la mitosis, cuando se recuperaron los procesos de transporte activo (ver secciones anteriores e Introducción General), NapB::GFP volvió a localizarse en el interior de los dos núcleos hijos. La pérdida de la localización nuclear de NapB durante la mitosis podría facilitar una posible función de esta proteína en el citoplasma, como ha sido demostrado en su homólogo de S. cerevisiae, Vps75p 166.

Figura II.22: Localización subcelular de NapB durante la mitosis. Serie de imágenes

tomadas del vídeo 9 en las que se puede ver que la localización nuclear de NapB en G2 se pierde durante la mitosis y se recupera una vez finalizado el proceso de división nuclear. Se indica el tiempo en minutos.

4.2.6 Mecanismos implicados en la regulación de la localización nuclear de