5.3 Recommendations 91
5.3.3 Recommendations for Further Studies 92
MUTACIONES EN MeCP2.
Trabajos previos en el sistema olfatorio y en hipocampo han demostrado que en ausencia de MeCP2 ocurren defectos en la maduración neuronal durante el desarrollo posnatal temprano, los cuales (aparentemente) se compensan más tarde en el desarrollo (65,178). Dado que en hipocampo las células de GD sufren neurogénesis adulta, nos preguntamos si las neuronas nuevas del organismo adulto recapitulan los defectos manifestados en el desarrollo posnatal temprano en ratones MUT. Para ello, evaluamos el porcentaje de maduración de células granulares originadas en el adulto, tomando ventaja del incremento en la neurogénesis adulta inducida por actividad epileptogénica.
Se partió de nuevos grupos de ratones WT y MUT de P63 días de edad expuestos a actividad epileptogénica mediante la administración de una sola inyección ip de AK. Debido a que el número de células BrDU positivas es muy bajo en los individuos controles (inyectados con PBS), para estos experimentos utilizamos sólo los grupos de animales inyectados con AK. Para el estudio de la maduración de las nuevas células granulares de GD se marcaron diferentes cohortes de progenitores celulares en tres días seguidos. Así, el 5to, 6to y 7mo días posteriores a la administración de AK (ventana temporal de mayor actividad proliferativa), se administraron 2 dosis de BrdU por día a cada animal, separadas por 7hs. Los animales se perfundieron a las 4 semanas desde la última dosis de BrdU (5 semanas desde la administración de AK), tiempo suficiente para que las nuevas células progenitoras neurales del GD alcancen una morfología característica de célula granular madura (148). La edad de los ratones al momento de la perfusión fue de P84 días (12 semanas).
Una vez obtenidas las criosecciones, por IHQ se realizaron triples inmunofluorescencias para marcadores neuronales. Los marcadores que se utilizaron fueron: anticuerpo anti-BrdU para marcar células en división, anticuerpo anti-Doblecortina (DCX)
como marcador de neuronas inmaduras y el factor de transcripción nuclear NeuN, proteína neuronal constitutiva específica de neuronas postmitóticas. Bajo microscopio se analizaron y contabilizaron las células BrdU-positivas a lo largo de la extensión rostro-caudal de la capa de células granulares de GD, visualizadas en todos los planos focales. La colocalización de los marcadores se analizó a través de todo el eje vertical Z de cada célula BrdU-positiva (cubriendo el soma celular entero). Contabilizadas y analizadas todas las células BrdU positivas por muestra de animal se procedió a calcular el porcentaje de nuevas neuronas producto de neurogénesis que alcanzaron la madurez (BrdU+NeuN+), el de las que todavía se encuentran en un grado intermedio de maduración (BrdU+DCX+NeuN+) y el de las inmaduras (BrdU+DCX+), a las 4 semanas desde la marcación de la última cohorte de progenitores celulares.
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Figura 24. Simple y doble marcación de las células BrdU positivas con los marcadores neuronales NeuN y DCX. A y B.
Ejemplos de neuronas en
estado intermedio de
maduración que colocalizan
con NeuN y DCX
(“doble”). En A se muestra
además la proyección
ortogonal del eje Z sobre los ejes X (línea verde) e Y (línea roja). C. Ejemplo de una neurona madura que
solo expresa NeuN. D.
Ejemplo de una neurona inmadura que solo expresa DCX. Los paneles en vertical son planos ópticos únicos mostrando los 3 canales de fluorescencia por separado y su superposición en el panel superior. Escalas en A: 25 µm y en B-D: 15 µm. Ne u N A S u p er p osi ci ón B rd U DCX B D C Su pe rposi ci ón B rd U DCX N euN
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En la Figura 24 pueden observarse ejemplos de simple y doble marcación de las células BrdU positivas con los marcadores neuronales NeuN y DCX, que indican el estado de madurez de dichas células.
Al determinarse los porcentajes de células BrdU positivas maduras, en estado intermedio de maduración e inmaduras (Figura 25), 5 semanas luego de la inducción de actividad con AK, se encontraron diferencias significativas entre los animales WT y MUT para MeCP2 [F2, 21)= 13,73; p<0,001]. En el caso de los ratones MUT se encontró que el porcentaje de nuevas células de GD que alcanzaron la madurez fue significativamente menor que en el caso de los ratones WT (MUTNeuN: 86,39±1,494%; WTNeuN: 93,13±0,762%). Sin embargo, mostraron una mayor proporción de células en estado intermedio de madurez e inmaduras (MUTDCX+NeuN: 9,76±1,521%; MUTDCX: 3,85±0,617%; WTDCX+NeuN: 5,46±0,537%; WTDCX: 1,41±0,481%).
Así, los ratones MUT presentan un retraso en la maduración de neuronas nacidas en el hipocampo adulto; las células en estado intermedio de maduración se acumulan, a expensas de un menor número de células maduras. Estos resultados muestran que los ratones que portan una proteína MeCP2 mutada (MUT) presentan defectos en la maduración de neuronas nuevas en el adulto, de manera similar a lo observado durante el desarrollo temprano (65,178). El aumento en la neurogénesis adulta inducida por actividad neuronal, nos permitió evidenciar que este defecto se recapitula en el animal adulto. El retraso en la maduración de células granulares de GD adulto sugiere que, si bien en respuesta a actividad
Figura 25. Porcentajes de células BrdU positivas en distintos estados de maduración en ratones WT y MUT inducidos a actividad neuronal con AK. A las 5 semanas posteriores a la administración de AK en los ratones WT el porcentaje de las nuevas células granulares que alcanzaron la madurez fue de más del 90%, mientras que dicho porcentaje fue significativamente menor en los ratones MUT, presentando éstos a la vez mayores valores de nuevas células granulares en estados de inmadurez. Cada barra representa para cada genotipo de MeCP2 el porcentaje promedio ± el error estándar (SEM) de células BrdU positivas colocalizando con el/ los correspondientes marcadores, normalizado al número total de células BrdU positivas en cada ratón. Cada barra está subdividida para indicar el porcentaje promedio de células BrdU positivas colocalizando con cada una de las combinaciones posibles de marcadores neuronales que indican los distintos estados de madurez de dichas células. n= 4-5 ratones por grupo experimental. Análisis de datos: ANOVA de dos vías seguido por Sidak´s test, * p<0,05; ** p<0,01.
W T M U T 0 5 1 0 1 5 2 0 7 5 1 0 0 C é lu la s B r d U + q u e e x p r e s a n a lg ú n m a r c a d o r ( % ) D C X D C X + N e u N N e u N
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sináptica se genera un número similar de neuronas nuevas en ausencia de MeCP2, éstas no se integrarían normalmente al circuito. Este defecto podría tener implicancias importantes en procesos de aprendizaje dependientes de hipocampo.