En cuanto a la disminución en el porcentaje de peso seco del residuo, fue posible determinar que existen diferencias estadísticamente significativas (p<0.005) entre cada uno de los factores evaluados y entre la interacción de estos, además que el tratamiento químico posee un efecto mayor en la disminución del peso seco del residuo a diferencia de las otras variables (Anexo 4.1). En consecuencia, se identificó que al realizar un pre tratamiento químico al tamo de arroz, la pérdida de peso seco es mayor que la pérdida de peso del residuo sin tratar; además de esto se evidenció que el extracto enzimático que permite una mayor pérdida de peso seco es aquel constituido únicamente por extracto enzimático celulolítico y hemicelulolítico u obtenido de Penicillium sp. H1-364. (Figura 6).
Figura 6. Pérdida de porcentaje de peso seco del tamo de arroz mediante la realización de un tratamiento químico y enzimático. Los resultados corresponden a la
media de 3 réplicas.
En lo que respecta a la producción de azúcares reductores equivalentes a glucosa, se observó que existieron diferencias estadísticamente significativas (p<0.005) entre los factores evaluados y la interacción de estos, a diferencia del hecho anterior, el mayor efecto en la producción de azúcares reductores es llevado a cabo por el tratamiento enzimático (Anexo 4.2); por tanto, fue posible determinar que el extracto lignocelulolítico que permitió obtener una mayor producción de azúcares y por tanto un mayor rendimiento, correspondió al extracto enzimático obtenido a partir de Pleurotus ostreatus MF 1-83 (Figuras 7 y 8).
Figura 7. Producción de azúcares reductores equivalentes a glucosa a partir del proceso de degradación del tamo de arroz sometido a un tratamiento químico y
enzimático. Los resultados corresponden a la media de 3 réplicas.
0:0 100: 0 0:10 0 50:5 0 75:2 5 25:7 5 0 50 100 150 Tamo tratado
Tamo sin tratar
Relación extracto enzimático celulolítico-ligninolítico
R en d im ie n to ( % )
Figura 8. Porcentaje de rendimiento en la producción de azúcares reductores equivalentes a glucosa. Los resultados corresponden a la media de 3 réplicas.
8. DISCUSIÓN
En la presente investigación fue posible identificar que las condiciones utilizadas para llevar a cabo la producción de extractos enzimáticos a nivel de biorreactor permitieron obtener un extracto enzimático celulolítico y hemicelulolítico con una alta actividad enzimática y a su vez de gran volumen; además las actividades enzimáticas obtenidas son similares a ensayos previos realizados a nivel de matraz por Fuentes & Garzón (2013).
Sin embargo, la actividad enzimática presentada por el extracto celulolítico de la presente investigación es baja respecto a la conseguida por Tuli et al. (2014), quienes hicieron uso de condiciones para la producción de los extractos similares a las de la presente investigación. No obstante, de acuerdo a lo reportado por Pereira et al. (2013) se recomienda que en futuras investigaciones se haga uso de un porcentaje de inóculo mayor, aproximado al 10%, ya que este permitiría obtener un extracto enzimático celulolítico con una actividad mayor, realizando un proceso de producción en menor tiempo (aproximadamente 72 horas).
Contrario a lo ocurrido durante la fermentación líquida para la obtención del extracto enzimático celulolítico, en el presente estudio, no se logró producir a nivel de biorreactor el extracto enzimático provenientes de P. ostreatus MF 1-83, lo cual ocurrió debido a que muy seguramente el microorganismo utilizado produjo glicoproteínas extracelulares como las denominadas adhesinas, la cuales probablemente permitieron que se realice una adhesión celular por parte de las hifas a la fase sólida del biorreactor (Gadd 2007). Lo anterior probablemente influyó para que el microorganismo no utilice el extracto de salvado de trigo como sustrato inductor para la producción de enzimas ligninolíticas. En consecuencia y considerando lo identificado por Quevedo (2011), residuos lignocelulósicos como el crisantemo presentan una buena degradación a nivel de biorreactor en términos de azúcares reductores liberados haciendo uso de P. ostreatus, debido a que la actividad ligninolítica es alta bajo condiciones de aireación y agitación específicas (hecho contrario a lo ocurrido en este estudio).
Por ende, es recomendable que la producción de dicho tipo de extractos enzimáticos se lleve a cabo utilizando un tipo de inóculo que posiblemente permita evitar el anterior fenómeno de adhesión, como lo es el caso del inóculo correspondiente a peso húmedo de micelio, y así poder llevar acabo el escalamiento de la producción del extracto a nivel de biorreactor bajo condiciones controladas, de la misma manera como se realizó en el estudio de Quevedo (2011).
Lo anterior, muy posiblemente permitiría que durante la producción de enzimas ligninolíticas por parte de P. ostreatus MF 1-83 a nivel de biorreactor ocurra un fenómeno similar al proceso de producción a nivel de matraz, el cual durante la presente investigación logró obtener un extracto enzimático con alta actividad ligninolítica, muy similar a la obtenida por Muñoz (2012) en investigaciones previas pero con una actividad menor a la reportada por Tinoco (2010).
Además de lo anterior, el extracto enzimático producido por P. ostreatus MF 1-83, permite que al adicionarlo en diferentes relaciones para producir las mezclas usadas, se produzca un aumento en la actividad celulolítica y hemicelulolítica de cada uno de los extractos lignocelulolíticos, ya que este microorganismo posee la capacidad de producir celulasas y hemicelulasas, además de las ligninasas (Iqbal et al. 2013).
La actividad enzimática celulolítica obtenida a partir del extracto de P. ostreatus es similar a la obtenida por Quevedo (2011) y superior a las reportadas por Isikhuemhen y Mikiashvilli (2009) y Váláskova y Baldrian (2009), las cuales se obtuvieron mediante la degradación de residuos agroindustriales como el crisantemo y paja de trigo, además de sustratos sintéticos como la celulosa cristalina respectivamente.
Por otra parte, no fue posible realizar la concentración del extracto enzimático celulolítico y hemicelulolítico debido a la presencia de isoformas de enzimas celulolíticas y muy probablemente hemicelulolíticas, debido a que se registró actividad enzimática tanto en el extracto concentrado como en el ultrafiltrado, indicando que el poro de membrana usado para llevar a cabo el proceso de ultrafiltración permitió el paso de enzimas con actividad celulolítica pero de peso molecular menor y mayor al tamaño de poro utilizado.
Lo anterior es acorde con lo reportado por Pereira et al. (2013), quienes identificaron que haciendo uso de membranas con poros de tamaño igual a 5 KDa, los extractos sufren una menor pérdida enzimática, permitiendo concentrar el extracto enzimático y aumentando la actividad de éste, la cual es otorgada por la presencia de celulasas de bajo peso molecular.
Con base en lo anterior, se recomienda que en futuros estudios se realice la identificación de las proteínas presentes a partir del extracto enzimático celulolítico y hemicelulolítico obtenido en la presente investigación, mediante la realización de zimogramas que permitan caracterizar las enzimas en términos de peso molecular, punto isoeléctrico y actividad enzimática. Para el caso de la caracterización de las endoglucansas y xilanasas podrían realizarse zimogramas en geles de electroforesis que posean carboximetilcelulosa y xilano de haya como sustratos, para realizar posteriormente la revelación de la actividad enzimática con rojo congo (Shah et al. 2014, Tuohy et al. 2003).
Por otra parte, mediante los resultados obtenidos en la presente investigación, es posible determinar que la realización de un tratamiento alcalino influye positivamente en la disminución del peso seco del tamo de arroz. Lo anterior se debe a que dicho tratamiento causó la remoción de la lignina presente y además permitió aumentar el área superficial del residuo, otorgándole accesibilidad a la enzimas (Cao et al. 2012), especialmente a las celulolíticas y hemicelulolíticas provenientes tanto de Penicillium sp. H1-364 como de Pleurotus ostreatus MF 1-83.
Por tanto, la acción que ejercen los extractos provenientes de Penicillium sp. H1-364 en la disminución del peso del residuo es mayor que la ejercida por los extractos provenientes de Pleurotus ostreatus MF 1-83, debido a que la actividad celulolítica y en especial la hemicelulolítica es mayor. Así las enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas pudieron actuar directamente sobre la hemicelulosa y parte de la celulosa, componentes mayoritarios en el residuo utilizado, en términos de peso seco de la planta (celulosa 35% y hemicelulosa 31.2%).
No obstante, durante este estudio también se logró obtener un porcentaje en la disminución del peso seco del 18% cuando se hace uso del residuo tratado y extractos lignocelulolíticos con relación 75:25, lo cual indica que al adicionar extracto enzimático proveniente de P. ostreatus MF 1-83 se logra obtener una buena disminución en el peso seco del residuo, a diferencia de lo reportado por Fuentes y Garzón (2013) quienes alcanzaron un porcentaje de pérdida cercano al 12% haciendo uso únicamente del extracto proveniente de Penicillium sp., y tamo sin tratar.
En lo referente a la producción de azúcares reductores, fue posible observar que la relación de extracto enzimático que favorece mayormente la producción de estos es 0:100, contrario a lo ocurrido en la disminución de peso seco. A raíz de esto, es posible proponer una hipótesis que explique la razón por la cual la disminución en el porcentaje de peso seco en el residuo cuando se hace uso de la relación 100:0 de extracto enzimático lignocelulolítico, no se ve reflejada en la liberación de azúcares reductores equivalentes a glucosa.
Esta hipótesis, hace referencia a que durante la degradación del tamo de arroz haciendo uso únicamente de un extracto enzimático proveniente de Penicillium sp. H1-364, se realizó una hidrólisis parcial de la celulosa, generando principalmente oligosacáridos o carbohidratos no necesariamente reductores, siendo probable que la actividad celulolítica, especialmente la actividad celobiohidrolasa asociada principalmente a la degradación de la región cristalina (Teeri 1997), o el tiempo de degradación, no hayan sido lo suficientemente eficientes para hidrolizar la región cristalina de la celulosa especialmente. Es por esto que se recomienda que en futuras investigaciones se lleve a cabo un perfil de azúcares solubles totales mediante la técnica de HPLC (Suzuki et al. 2005).
Como consecuencia de lo anterior, se presenta un efecto mayor en la liberación de azúcares cuando se realiza un tratamiento enzimático, a diferencia de cuando se usa un tratamiento químico en el residuo, ya que este último actúa degradando únicamente la lignina, y por otro lado los azúcares se obtienen a partir de la hemicelulosa y celulosa presente.
Finalmente, es de suma importancia considerar que la degradación del tamo de arroz haciendo uso de extractos enzimáticos y a su vez de un pre tratamiento alcalino favorable, suponen una serie de ventajas respecto al uso de microorganismos en fermentación sólida para la degradación. La principal ventaja radica en que la pérdida de los carbohidratos presentes es menor ya que a diferencia de los microorganismos, los extractos enzimáticos no consumen los azúcares liberados (Yamagishi et al. 2011) y por tanto podrían ser usados con mayor eficiencia en diversos procesos biotecnológicos como por ejemplo la producción de bioetanol.
9. CONCLUSIONES
1. La realización de un tratamiento químico posee un efecto significativo en la disminución del peso seco del tamo de arroz.
2. La realización de un tratamiento enzimático posee un efecto significativo en la liberación de azúcares reductores.
3. Con el fin de degradar eficientemente el tamo de arroz en términos de disminución del peso seco del residuo se requiere realizar un tratamiento químico alcalino, haciendo uso del extracto compuesto en un cien por ciento por extracto enzimático de Penicillium sp. H1-364.
4. Con el fin de obtener azúcares reductores, se requiere utilizar el extracto compuesto en un cien por ciento por extracto enzimático de P. ostreatus MF 1-83, sin hacer uso de un tratamiento químico.
10. RECOMENDACIONES
1. Evaluar la producción enzimática celulolítica realizando un proceso de optimización del inóculo.
2. Evaluar la producción enzimática ligninolítica a nivel de biorreactor realizando un proceso de optimización de parámetros como el tipo de inóculo, el sustrato inductor y las condiciones de aireación.
3. Realizar una caracterización de las proteínas obtenidas en términos de peso molecular, punto isoeléctrico y actividad enzimática, mediante un zimograma utilizando carboximetil celulosa como sustrato y rojo cono como revelador.
4. Determinar carbohidratos solubles mediante HPLC, posteriormente de haberse realizado la degradación del residuo.
5. Realizar un análisis de lignina, celulosa y hemicelulosa, posteriormente de haberse realizado la degradación del residuo.
6. Evaluar la producción enzimática ligninolítica a nivel de biorreactor realizando un proceso de optimización de parámetros como el tipo de inóculo, el sustrato inductor y las condiciones de aireación.
7. Realizar una caracterización de las proteínas obtenidas en términos de peso molecular, punto isoeléctrico y actividad enzimática, mediante un zimograma utilizando carboximetil celulosa como sustrato y rojo cono como revelador.
8. Determinar carbohidratos solubles mediante HPLC, posteriormente de haberse realizado la degradación del residuo.
9. Realizar un análisis de lignina, celulosa y hemicelulosa, posteriormente de haberse realizado la degradación del residuo.
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