4. Summary Conclusions and Recommendations
4.3 Recommendations
Para la realización de los experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real se utilizaron los kits para retrotranscripción (Exiqon. Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns. miRCURY LNA™ microRNA PCR, Polyadenylation and cDNA synthesis kit II (8-64 rxns). Version 4.1 y 5.2. Productos No. 203300 y 203301. Exiqon, Skelstedet 16 2950 Vedbaek, Denmark) y para la preparación de la mezcla maestra (Exiqon. SYBR® Green master mix, Universal RT, 25ml. miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR, SYBR® Green master mix, 2500 rxns of 20µl or 5000 rxns of 10µl. Exiqon, Skelstedet 16 2950 Vedbaek, Denmark). La figura 6. muestra el plan de trabajo que se realizó con cada una de las muestras incluidas en el estudio.
Figura 7.Plan de procesamiento de las muestras .De cada muestra se realizó un procedimiento de extrac- ción de RNA y tres reacciones de retrotrascripción independientes. Con cada cDNA obtenido se realizó un plato completo de PCR analizando todos los microRNAs especificados previamente.
Identificación de pacientes candidatos Firma de consentimiento informado
Toma de muestra de médula ósea Tubos 2 y 4
Verificación del diagnóstico de LLA por citometría de flujo
Separación de mononucleares
Cuantificación y evaluación de viabilidad Selección del tubo con mejor calidad
Extracción de RNA Concentración > a 5 ng/µl
260/280 1.8 a 2.0
Retro-transcripción 1 Retro-transcripción 2 Retro-transcripción 3
PCR cuantitativa plato No. 1 PCR cuantitativa plato No. 2 PCR cuantitativa plato No. 3 Criopreservación en DMSO +
Suero fetal bovino
Luego de la firma del consentimiento informado y la realización del procedimiento de aspirado y biopsia de la médula ósea, los tubos marcados como No. 2 y No. 4 fueron trasladados al banco de tumores Terry Fox del Instituto Nacional de Cancerología, manteniendo las muestras a cuatro grados. Se realizó el procedimiento de separación de mononucleares de los tubos 2 y 4 como se describió en 4.3.3.1 seguido de la cuantificación por el protocolo descrito. La muestra con mayor densidad y viabilidad fue seleccionada para continuar los demás experimentos.
De la muestra seleccionada se tomaron 0.5 ml los cuales fueron transferidos a un tubo falcon de 15 ml al cual se adicionaron 1 ml de DMSO estéril y 9 ml de suero fetal bovino estéril seguido de congelación en un tanque de nitrógeno líquido. Los 0.5 ml restantes fueron transferidos al área de extracción de RNA para la realización del procedimiento. El RNA obtenido fue conservado a - 80 grados centígrados hasta el momento de su utilización, diluido en aliquotas con una concentración final de 5 ng/µl.
4.3.5.1 Retrotranscripción y PCR cuantitativa en tiempo real
La retrotranscripción para la síntesis del cDNA fue realizada siguiendo las especificaciones del fabricante con un kit específico para análisis de miRNAs, el cual realiza la retrotranscripción y la poliadenilación en un solo proceso (Exiqon. Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns. miRCURY LNA™ microRNA PCR, Polyadenylation and cDNA synthesis kit II (8-64 rxns) Version 4.1 y Versión 5.2).
Por ser considerada la parte más variable del experimento y por recomendación del fabricante se realizaron tres reacciones independientes. El cDNA producto de cada reacción fue utilizado de forma inmediata para la preparación de la mezcla maestra para PCR seguido del pipeteo en el plato de 96 pozos específico del estudio, siendo realizada la PCR el mismo día de elaboración del cDNA. Este proceso se repitió para cada una de los platos, generando entonces tres platos independientes por paciente como se muestra en la figura 6. Los casos de LMA y de linfoma en remisión incluidos fueron utilizados como controles operativos y como control negativo se utilizó una mezcla de agua mas SYBR® Green sin adición de cDNA.
El protocolo de retrotranscripción y PCR fue el siguiente
1. Los reactivos contenidos en el Kit deben ser mantenidos a - 20 grados centígrados hasta el
momento de su utilización.
2. Todos los pasos del proceso serán manteniendo los reactivos en hielo hasta el momento de su
utilización. No retire la mezcla de enzima de la nevera hasta el momento de su uso.
3. Descongele el "Buffer" de reacción 5x y el agua libre de nucleasas e inmediatamente
colóquelos en hielo y mezcle en un agitador vortex.
4. Inmediatamente antes de su uso retire la mezcla de enzima de la nevera y mézclela
golpeando suavemente el tubo.
5. Centrifugue todos los reactivos.
6. Para la preparación de la cantidad requerida para una placa de 96 pozos adicione en el
siguiente orden
• Buffer de reacción 5x (Tubo de tapa verde): 2 µl
• Agua libre de nucleasa (Tubo de tapa azul): 5.5 µl (Si utiliza el RNA-Spike adicione
solamente 4.5 µl de agua)
• Mezcla de enzima (Tubo de tapa roja): 1 µl
• RNA molde (Concentración final de 5 ng/ µl): 2 ul
• Volumen final de la reacción: 10 µl
7. Mezcle la reacción en un agitador vortex o por pipeteo 8. Incubación e inactivación
• Todas las reacciones se realizan en el termociclador TC-3000, ubicado en la zona específica
para estos equipos en el Banco de Tumores Terry Fox del Instituto Nacional de Cancerología
• El programa requerido fue grabado con anterioridad al procesamiento de la primera muestra
y no se modificó durante todo el estudio
• Incubación a 42 grados centígrados durante 60 minutos • Inactivación a 95 grados centígrados por 5 minutos • Enfriamiento inmediato a 4 grados centígrados
• Las muestras fueron mantenidas a 4 grados si su procesamiento era inmediato o congeladas a
9. Preparación de PCR cuantitativa en tiempo real
• Retire el plato de PCR de 96 pozos específico del estudio de la nevera de - 20 grados • Antes de retirar el sello centrifugue a 1500g durante un minuto
• Traslade el plato a la cabina de colocación de muestras
• Retire el cDNA de la nevera y trasládelo a la cabina de colocación de muestras
• Retire de la nevera de - 20 grados el SYBR® Green Master Mix. En un tubo prepare una
mezcla de 500 µl de SYBR® Green Master Mix y 495 µl de agua libre en nucleasas
• Traslade el tubo que contiene la mezcla del SYBR® Green Master Mix y agua en las
cantidades especificadas a la cabina de colocación de muestras
• Al tubo que contiene la mezcla de SYBR® Green Master Mix y Agua, adicione 5 µl de
cDNA
• Retire el sello del plato de 96 pozos y con ayuda de una pipeta nulticanal específica para el
estudio adicione 10µl de cDNA en cada pozo. Utilice una linea de puntas con filtro por cada linea de pozos en el plato
• Selle el plato con el sello óptico (LightCycler® 480 Sealing Foil. Roche Diagnostics) 10.Centrifugue el plato en la centrífuga de platos a 1500g x 1 minuto.
11.Coloque el plato en el equipo de PCR cuantitativa en tiempo real (LightCycler® 480 Real-
Time PCR System. Roche).
12.Una vez el equipo realice la lectura del código de barras del plato, identifique la placa con el número asignado al paciente seguido de _1; _2 o _3 dependiendo del plato que este procesando.
13.Previamente al procesamiento de la primera muestra se grabo una macro llamada
¨microRNA¨ con el siguiente programa:
• Activación de la polimerasa / denaturación: 95 grados centígrados por 10 minutos • Amplificación: 45 ciclos de amplificación así:
• 95 grados centígrados por 10 minutos
• 60 grados centígrados por 1 min, ramp-rate 1.6 grados/Segundo. Lectura óptica • Análisis de curvas de melting: Sí
14.Una vez colocado el plato en el equipo, inicie la macro correspondiente
15.Una vez finalizado realice el análisis antes de grabar. Seleccione la opción ¨Abs Quant/2nd Derivative Max.¨. Esto calculara el Ct de cada uno de los pozos
16.Grabe el archivo, retire el plato del equipo y apaque el instrumento y el computador en ese
orden