El objetivo del estudio teórico que se presenta no es tanto elucidar el efecto del disolvente sobre la intensidad de fluorescencia de una sustancia sino justificar que estos cambios tienen una aplicación analítica. Para ello se parte de la base de que, en una disolución, tanto el disolvente (D) como el soluto (que será el analito, (A), afectan a la intensidad de fluorescencia del fluoróforo, en una extensión que depende de la proporción relativa en la que se encuentren ambos. En este apartado se va a especificar cómo es esa relación, lo que permitiría obtener el modelo analítico que se está buscando.
Se han considerado dos formas distintas de abordar esta parte final del modelo, que se pueden denominar: aproximación formal y aproximación empírica.
Esta es la alternativa que se utilizó inicialmente en el desarrollo del modelo. Se basa en considerar que la fluorescencia obtenida con una mezcla (o una disolución) es la media ponderada de los valores de fluorescencia obtenidos con cada uno de los componentes por separado, siendo las fracciones en volumen (Xv) los factores de ponderación. El uso de Xv se ha considerado
después de revisar la bibliografía y encontrar diferentes publicaciones en las que se usa para obtener propiedades físicas ponderadas en disolución, como el
momento dipolar55, relacionados con este trabajo. Con esto, la ecuación del
modelo queda de la siguiente forma:
F =FDXv ,D+FAXv , A=FD+ (FA−FD)Xv , A (2.35)
donde FD y FA son las fluorescencias observadas cuando sólo el analito o el
disolvente están presentes en el medio. Estos valores se obtendrían a partir de la ecuación (2.33), sustituyendo el índice de refracción y la constante dieléctrica del medio, por el del analito (para FA) o el disolvente (para FD) respecticvamente. Es
importante indicar que para un analito y un disolvente dados FA y FD son
constantes. Si se considera, de nuevo, un efecto de solvatación preferencial por parte del analito o del disolvente, la ecuación queda:
F =FD+ K
PS(F
A−FD)Xv, A
1+ Xv ,A(KPS−1) (2.36)
La anterior ecuación se puede arreglar de la siguiente forma: F−FD FD = ΔF =
(
FA−FD FD)
KPSX v, A 1+ Xv ,A(KPS−1) (2.37)55 Sengwa, R. J.; Abhilasha, M.; "A Comparative Study of Non-Polar Solvents Effect on Dielectric Relaxation and Dipole Moment of Binary Mixtures of Mono Alkyl Ethers of Ethylene Glycol and of Diethylene Glycol with Ethyl Alcohol" J. Mol. Liq. 2006, 123, 92-104. Boer, G. J.; Sokolik, I. N.; Martin, S. T.; "Infrared Optical Constants of Aqueous Sulfate-Nitrate-Ammonium Multi-component Tropospheric Aerosols from Attenuated Total Reflectance Measurements: Part II. An Examination of Mixing Rules" J. Quant. Spectros. Rad. Trans. 2007, 108, 39-53. Mehra, R.; "Application of Refractive Index Mixing Rules in Binary Systems of Hexadecane and Heptadecane with n-Alkanols at Different Temperatures" Proc. Indian Acad. Sci. 2003, 115, 147-154.
La ventaja de Δ F como parámetro de medida sobre F es que el primero es independiente de la KFins, es decir, de las condiciones instrumentales y de la concentración de fluoróforo usadas. Obviamente esta ecuación admite dos situaciones límite dependiendo de la concentración de analito: para concentraciones bajas se debería esperar una relación lineal mientras que para concentraciones altas se pierde la linealidad.
1≫Xv, A
(
KPS−1)⇒
1+ X v , A(
K PS−1)
≈1⇒
ΔF =KPS(
FA−FD FD)
Xv , A (2.38a) 1≪Xv, A(
KPS−1)
⇒
1+ Xv , A(
KPS−1)
≈Xv ,A(
KPS−1)⇒
ΔF =FA−FD FD KPS (KPS−1) (2.38b)La aproximación empírica desarrollada presenta ventajas e inconvenientes. Las ventajas más importantes son:
1.- Explica comportamientos que se han observado experimentalmente en diferentes sistemas, ya que, en muchos casos, el efecto de la concentración del analito en la señal de fluorescencia produce un primer tramo de respuesta lineal seguido de otro tramo en el que deja de haber tal respuesta.
2.- Permite predecir que la sensibilidad de una sustancia por este método dependerá de la diferencia FD-FA, es decir, de la diferencia de señales que se
obtengan cuando el fluoróforo se encuentra solo en presencia del disolvente (FD)
o del analito (FA). De acuerdo con esto, las figuras 2.7, 2.8 y 2.9 permitirían
hacer predicciones sobre cómo variaría F para diferentes valores de Xv,A. Para
a) Conocidos (o estimados) los valores de PF y ΥF del fluoróforo, se va a
la correspondiente figura.
b) A partir de los datos de los valores de nD y εD, se obtiene el valor de
FD. Lo mismo para FA.
c) Se unen los puntos FD y FA por una línea, y esta da la variación de F en
función de la concentración de analito.
Por el contrario, los incovenientes son:
1.- Simplifica bastante la realidad, ya que parte de una dependencia supuesta dada por la ecuación (2.35).
2.- Según la ecuación, la relación de F con X es lineal y esta dependencia sólo se pierde por el hecho de que exista solvatación preferencial.
2.6.2.- Aproximación formal
Esta aproximación, más laboriosa, busca encontrar una relación teórica entre εM y nM, y la concentración del analito.
a) Dependencia de la constante dieléctrica
Como se sabe, la constante dieléctrica de una sustancia es consecuencia de sus propiedades físico-químicas a nivel molecular, sobre todo de su polarizabilidad ( α ) y de su momento dipolar (μ). Para una sustancia pura, la ecuación que relaciona α , μ y ε es la ecuación de Langevin-Debye (o simplemente, ecuación de Debye), que viene dada por:
(
ε−1 ε+ 2)
= 4 π N 3(
α+ μ2 3 kBT)
= 4 π NA 3 ρ M(
α+ μ2 3 kBT)
(2.39)donde N es el número de moléculas de sustancia por unidad de volumen, M es la masa molar, ρ es la densidad de la sustancia, NA es el número de Avogadro, kB es
la constante de Boltzmann y T la temperatura.
Esta ecuación admite diferentes formulaciones en función de las unidades en las que se expresen las diferentes magnitudes56. Posteriormente,
Onsager57 mejoró el modelo químico-físico propuesto por Debye y propuso la
siguiente ecuación:
(
(ε−n2)(2 ε+ n2) ε(
2+ n2)
2)
= 4 π N 3(
μ2 3 kBT)
(2.40)En ella la polarizabilidad de la molécula ha sido sustituida por su índice de refracción de acuerdo con (2.29). El propio Onsager introdujo una versión simplificada de esta ecuación para cuando la sustancia tenía carácter polar, es decir, cuando
ε−n2≈ε
⇒
2 ε+ n2≈2ε (2.41) con lo que la ecuación (2.40) queda:ε=2 π N
3
(
μ2
3kBT
)(
2+ n2
)
256 En general, los valores de α se suelen tabular en Å3, los de µ en Debyes y los de ρ en gmL-1. En
este caso la ecuación anterior es:
(
ε−1ε+ 2
)
=2.5 ρM(
α+8.1μ2)
Cuando el medio está conformado por "n" sustancias diferentes, Onsager58 demostró que la constante dieléctrica del medio viene dada por:
εM=2 π 3
∑
i=1 n Ni(
μi 2 3 kBT)(
2+ ni 2)
2 (2.42)lo que indica que la εM se obtiene por combinación de las constantes dieléctricas
de las sustancias que lo componen, siendo la fracción molar en volumen (Xv,i) el
factor de ponderación. Para una mezcla de un soluto (A) y un disolvente (D):
εM=εD−(εD−εA)Xv ,A (2.43)
En algunos casos puede ocurrir que el fluoróforo sea químicamente más afín a uno de los dos componentes de la disolución, interaccionando prioritariamente con él (solvatación preferencial). Hay varias formas de poner de manifiesto este efecto, pero un modelo sencillo se basa en usar la constante de solvatación preferencial KεPS59.
58 Onsager, L.; "Electric Moments of Molecules in Liquids" J. Am. Chem. Soc. 1936, 58, 1486-1493. 59 Para incluir este efecto, un modelo simple se basa en que las fracciones molares de analito y disolvente en torno al fluoróforo (XD,loc y XA,loc) son diferentes de las fracciones molares que se
corresponden con la composición real. Estas fracciones molares locales están en equilibrio con las fracciones molares generales y a partir de aquí se define la constante de solvatación preferencial ( KεPS):
KPS=XA ,locXD
XD, locXA
Si KεPS=1 no hay solvatación preferencial. Cuando KεPS>1, el fluoróforo está solvatado
De acuerdo con ello, la ecuación anterior queda: εM=εD+ (KεPSε
A−εD)Xv,A (2.44)
b) Dependencia del índice de refracción
La ecuación de Lorentz-Lorenz establece la dependencia del índice de refracción de un medio con la polarizabilidad de las moléculas que lo componen60, tanto para una sustancia pura como para una mezcla de ellas.
n2−1 n2 +2= 2 π 3 N α (2.45) nM2−1 nM2 +2= 2 π 3
∑
i=1 n Niαi (2.46)Al igual que en el caso de la ecuación de Onsager, al combinar de estas dos ecuaciones se desprende que el índice de refracción de una mezcla se puede obtener por ponderación de los índices de refracción de las especies que la componen, siendo las fracciones molares en volumen el factor de ponderación. En definitiva:
(
nM2−1 nM2+2)
=(
nD2−1 nD2+2)
+[(
nA2−1 nA2+2)
−(
nD2−1 nD2+2)]
Xv ,A (2.47)que permite relacionar nM2 con la concentración de analito. Usando de nuevo la idea de la solvatación preferencial:
(
nM2−1 nM2+2)
=(
nD2−1 nD2+2)
−[(
nD2−1 nD2+2)
−Kn PS(
nA 2−1 n2A+2)]
Xv,A (2.48)60 No hay que confundir esta ecuación con la (2.29) en la que se establece la relación entre la polarizabilidad de una molécula y su tamaño.
donde KnPStiene el mismo significado que antes, pero referido a este tipo de interacciones. Usando la misma notación que en (2.44):
nc , M2 =n
c ,D 2
−
[
nc ,D2 −KnPSnc , A2]
Xv, A (2.49)c) Modelo final
Para obtener el modelo analítico final basta con sustituir las expresiones de εM (2.44) y de nM2 (2.35) en la ecuación (2.33). Es obvio que el resultado será
una ecuación muy complicada y difícil de manejar e interpretar, pero permitirá establecer una relación más fidedigna entre F y la concentración del analito.