Reflection on project methodology, processes,

Para conocer el nivel de mortalidad que provocan tres aislados de los hongos, provenientes de larvas de las especies Phyllophaga sp., Cyclocephala sp. y Anomala sp., se llevó a cabo una evaluación de estos aislamientos en larvas de P. ravida, (especie presente en la zona de estudio). Estas larvas fueron mantenidas en laboratorio como se describe a continuación.

3.3.1 Obtención de larvas para el bioensayo

Para la obtención de las larvas que se utilizaron en el experimento se capturaron adultos, que se colocaron en jaulas para su apareamiento y oviposición hasta la obtención de larvas, para ello se utilizaron las técnicas de como Reinhard (1940); Teetes et al., (1976); King (1994); Crocker et al., (1996) mismas que se adecuaron a las condiciones de la localidad (Hidalgo et al., 1996; Nájera, 1998). A continuación, brevemente se describe la metodología utilizada.

3.3.1.1 Captura de adultos

La captura de adultos se llevó a cabo por las noches durante la primera semana del mes de Julio; se utilizó una trampa tipo pantalla con una fuente de luz mercurial de

del municipio de Tepatitlán, Jal.; así como una trampa de luz negra (Pérez, 1991) instalada en el Campo Experimental Altos de Jalisco del INIFAP, conectada a la corriente eléctrica y ubicada a 2.0 metros de altura. Dicha trampa consiste en una barra de luz negra en posición vertical de 15 watts provista de cuatro láminas de plástico transparente y un depósito de aluminio, en el cual son recibidos los insectos que atraídos por la luz chocan con las láminas y caen.

Al mismo tiempo se recolectaron los individuos que se encontraban en áreas cercanas a la lámpara, sobre todo aquellos que se encontraban copulando. Los especimenes colectados en la trampa y en el campo se colocaron en botes de plástico de un litro, con perforaciones en la tapa y se concentraron en el laboratorio.

3.3.1.2 Separación de la especie P. ravida

La separación de la especie P. ravida, se llevó a cabo de acuerdo a las claves de King (1984), en las que se toma en cuenta el genital masculino, así como otras características morfológicas de la especie como lo son la forma de las uñas mesotarsales masculinas (Morón, 1986).

3.3.1.3 Producción de huevecillos

Una vez identificada la especie, se formaron grupos de 25 parejas de adultos y fueron colocadas en cubetas de plástico de 20 litros con perforaciones en la tapa, con aproximadamente 15 cm de suelo de textura franca con 22% de humedad (Goonawardene, 1985), el suelo fue esterilizado en una autoclave a una presión de 20 libras/pulgada2 durante 1.5 horas o equivalente; para posteriormente ventilar el suelo durante 24 horas. En el centro de la cubeta se colocó un frasco de vidrio con 250 cc de agua y ramas de Acacia farnesiana (L), que sirve de alimento y sostén de los insectos para la cópula. La temperatura a la que permanecieron fue de 22 ±1ºC.

Diez días después se revisaron las cubetas, se extrajeron los huevecillos y se colocaron en charolas de plástico de 30x20x7 cm, con una capa de 1.5 cm de suelo

húmedo cubierto con papel absorvente en donde permanecieron alrededor de 8 días. Los huevecillos de mayor tamaño fueron pasados en grupos de 60 a contenedores de 32x21x13 cm con una capa de 3 cm suelo franco esterilizado de así como germinado de arroz, en donde emergen las larvas.

3.3.2 Cría de larvas

Las larvas recién emergidas iniciaron su alimentación consumiendo las pequeñas raíces del arroz; a los 7 días se cortó el arroz en su parte aérea y se realizó una nueva siembra de germinado de arroz, en otra capa de 3 cm de suelo; a los 8 días se aplicó la última capa de suelo y se realizó la última siembra de arroz. Desde el momento en que se depositaron los huevecillos en el contenedor hasta la última siembra transcurrieron 21 días durante los cuales se desarrollaron las larvas de primer estadio.

A los de 30 días, se vació el suelo sobre un plástico negro para separar las larvas de primer y segundo estadio. Las de primer estadio fueron regresadas al contenedor con suelo y germinado de arroz y las de segundo estadio fueron colocadas en forma individual en vasos de plástico de 200 ml, los cuales contenían 100 cc de suelo y dos plántulas de maíz de 5 días de emergidas. Las plántulas fueron remplazadas cada semana; la alimentación de las larvas fue complementada con rebanadas de zanahoria y permanecieron en estas condiciones hasta el tercer estadio y fase final del desarrollo larval.

Para facilitar el manejo del segundo y tercer estadio, los vasos son colocados en grupos de 20, sobre charolas de 44x35x3 cm e introducidas en bolsa de plástico, lo cual permite conservar humedad. Todo el alimento fue previamente desinfectado con hipoclorito de sodio al 1% y durante todo el proceso de cría, se mantuvo una temperatura ambiental de 23 ° C. Finalmente, las larvas de tercer estadio fueron individualizadas en cajas de Petri de 12 x 1.5 cm con suelo húmedo y alimentadas

con rebanadas de zanahoria (Cherry y Clein, 1997) hasta ser utilizadas en el bioensayo.

3.3.3 Aislamientos

Para el bioensayo se seleccionaron los aislados Bb1, Bb2 y Bb3 obtenidos en la colecta de campo y con las larvas en tercer estadio de P. ravida, provenientes de la cría masiva obtenidas en el laboratorio.

3.3.4 Inoculación de larvas

Para la inoculación de las larvas, se utilizó una suspensión de conidiass a la concentración de 1x108 conidias/ml. Las larvas fueron inoculadas en forma individual; cada larva fue introducida en la suspensión contenida en un vaso de precipitado durante 30 segundos (Moorhouse, 1993); posteriormente fueron colocadas a cajas de Petri, en donde permanecieron alimentándoseles con rebanadas de zanahoria (Raid y Cherry 1992; Cherry y Clein 1997; Converse y Greval 1998). El experiemento se realizó a 25ºC en condiciones de laboratorio. Cada 24 horas se revisaron las larvas y se registró el número de larvas muertas por hongo (Keller et al., 1999). Para determinar si una larva estaba muerta, se detectó si dicha larva no se movía, al tocarla en la superficie ventral del tórax. Las larvas muertas se separaron, se lavaron con agua destilada estéril sobre una capa doble de papel filtro, para favorecer la esporulación del hongo (Barson et al., 1994).

3.3.5 Diseño

El diseño experimental utilizado en este bioensayo fue completamente al azar, con 4 tratamientos y 4 repeticiones (Lezama et al., 2000). Cada tratamiento estuvo formado por cada aislado del hongo y el testigo, el cual estuvo formado por la aplicación de agua destilada estéril al 0.1% de Tween. En total se utilizaron 20 larvas por unidad

experimental en cada tratamiento.

3.3.6 Análisis estadístico

Los datos se sometieron a un análisis de varianza y una prueba de medias de acuerdo a Tukey 0.05 (Stimac et al., 1993), utilizando el programa SAS (1993).

IV.-RESULTADOS