3.3 Empirical Methodology
3.3.1 Regression Specifications
Dado el enorme acumulo de conocimientos genéticos implicados en la expresión de virulencia, logrados en éste departamento de investigación dedicados a la línea de Salmonella, cuyos productos requieren de la actividad de proteínas disulfuro tiol óxido reductasas, nos ha llevado a interesarnos en la funcionalidad de la Familia de las proteínas TDOR del sistema periplasmático vía oxidativa, que ha de suponer, presentan una gran relevancia en el plegamiento de distintos factores de virulencia , como son : proteínas de virulencia, flagelos y fimbrias , cuyas proteínas constituyentes requieren de la formación puentes disulfuro para su configuarción, correcto plegamiento, inserción y funcionamiento y que puedan estar influyendo en la capacidad invasiva o en la supervivencia intracelular de las bacterias patógenas (Rotger, 1995; Rodríguez - Peña, 1996 y Mendoza del Cueto, 2002).
Siguiendo con los trabajos iniciados y publicados con respecto a los “Estudios de caracterización de regiones homólogas entre regiones del cromosoma en S. typhi (dsbA) y del plásmido de S. enteritidis (dlp)” (Rodríguez-
Peña, 1996), genes cuyos productos enzimáticos, presentan un centro catalizador Cys-Xaa-Xaa-Cys característico de las óxido reductasas de puentes disulfuros, las que se encuentran implicados con la capacidad de virulencia de
Salmonella. Y conociéndose además que, el gen cromosómico dsbA presenta mayor relevancia comparadas a la expresión del gen dlt /dlp en cuanto a adhesión, invasión y supervivencia bacteriana (Mendoza del Cueto, 2002), se
tuvo como objeto de estudio seguir con otros posibles genes implicados, encargándose el presente trabajo experimental del estudio funcional del gen
dle y la manera interrelacionada con dsbA y dlp, genes codificadores de proteínas TDOR con proteínas de virulencia, fimbrias y flagelos de Salmonella enteritidis 82139 portadora de plásmido. Ya contando con los estudios de homología (Rodríguez-Peña, 1995), caracterización y de los respectivos efectos ambientales sobre mutantes de Salmonella deficientes en oxidorreductasa de puentes disulfuro (Agudo G., 2000).
Ya contando con cepas con mutación simple, se decidió proseguir con los estudios de construcción de otras simples, dobles y triples mutantes, que permitierán el estudio de expresión del fenotipo de invasión del gen cromosómico dle presente en Salmonella enteritidis 82139C y su expresión fenotípica con respecto a las primeras fases infectivas de invasión: internalización, supervivencia y multiplicación en líneas celulares epiteliales Henle 407 y MDCK. Gen, que a pesar de no presentar una homología significativa con respecto a dsbA, presenta en su producto el centro catalizador característico Cys-Xaa-Xaa-Cys de la familia Dsb. Razón por la que se asume de una posible función del gen dle implicado en la virulencia de Salmonella, semejante a lo determinado en dlp y srgA (genes plasmídicos codificadores de Dlp y SrgA, determinados en S. enteritidis y S. typhimurium, respectivamente) y dlt (gen cromosómicos de S. typhi). Del cual, ya conociéndose de la implicancia de SrgA (conocido como Dlp) en la biogénesis de fimbrias plasmídicas PEF (localizado próximo al downstream del operón), hace inferir de una posible participación de Dle (homologo a Dlp) en la biogénesis de fimbrias cromosómicas SEF (cuyo gen codificador guarda similar relación de localización próximo downstream del operón). La presencia de éstas fimbrias sugiere que la adhesión a superficies celulares y no celulares puede ser un
paso crítico en la supervivencia de S. enteritidis en el medio ambiente, las que responden a factores de medio como pH y osmolaridad.
Salmonella organismo procariota objeto de estudio, es una bacteria
gram negativa móvil, anaerobia facultativa perteneciente a la familia
Enterobacteriaceae, que contiene péptido glucano en el espacio periplasmático unido covalentemente a las lipoproteínas de la membrana externa. El espacio periplasmático, tiene la consistencia de un gel que contiene una elevada concentración de enzimas degradativas y de proteínas de transporte, el contener tan sólo una pequeña cantidad de péptido glucano las paredes celulares de las bacterias gram negativa son más sensibles a la ruptura mecánica. La capa de péptido glucano de las bacterias gram negativa está rodeada de una membrana externa compuesta de lipoproteínas, lipopolisacáridos (LPS) y fosfolípidos. Las lipoproteínas de la membrana citoplasmática están constituídas por proteínas unidas covalentemente a lípidos, las de la membrana externa de la pared celular constan de proteínas unidas no covalentemente a lípidos. “La membrana externa”, presenta varias funciones especializadas, su fuerte carga negativa es un factor importante para evadir la acción de los fagocitos y del complemento, dos componentes de las defensas del huésped (Tortora G. et al, 1993).
El periplasma en las bacterias no es estático sino dinámico, capaz de adaptarse a los cambios que ocurren en los medios, externo e interno, que le rodean. Se ha estimado que “el espacio periplásmico está lleno de proteínas”, lo que genera un ambiente altamente viscoso con muy baja cantidad de agua (Oliver, 1999 y Medina J. et al, 1996). Las proteínas que residen en el espacio periplasmático realizan importantes funciones, siendo la más considerada por favorecer a la “biogénesis de proteínas” que entran en el
compartimiento con componentes destinados a la incorporación dentro del péptido glucano, membrana externa o cápsula (Oliver, 1999).
Las proteínas periplásmicas se encuentran clasificadas en cuatro categorías: i) proteínas de unión a iones o solutos, que junto con los receptores de quimiotaxis detectan azúcares, aminoácidos, péptidos, vitaminas e iones, ii) enzimas catabólicas que degradan moléculas complejas para su transporte a través de la membrana interna, iii) enzimas destoxificadoras, que tienen un papel protector, y iv) enzimas o proteínas que favorecen la biogénesis de las principales proteínas de la membrana, apéndices, lipopolisacáridos, péptido glucano y cápsula (Oliver, 1999).
Las proteínas que no van a formar parte del citoplasma han de ser “encarriladas” a su localización intracelular correspondiente, las que son secretadas al medio exterior lo pueden hacer de forma directa o haciendo uso de canales de exportación. La translocación de las proteínas a través de membranas puede llevarse a cabo por varias rutas, dependiendo de la naturaleza de la señal y del sustrato. La mayoría de las proteínas bacterianas cuando acaban de ser sintetizadas disponen de una secuencia señal en la región N-terminal denominada “péptido señal” que las capacita para ser exportadas y catalizadas por un aparato general de exportación, denominado Sec-dependiente. Sin embargo, proteínas como toxinas, enzimas degradativas y otros factores de virulencia poseen rutas especializadas diferentes de la maquinaria de exportación (Tsuyoshi M. et al, 2004). Las proteínas de las bacterias gram positivas son translocadas y liberadas directamente al medio, mientras que bacterias gram negativas la ruta es más compleja, las que pueden ser liberadas dentro del periplasma y permanecer integradas o ser transportadas a través de la membrana externa (Pugsley, 1993).