6. Conclusions and Implications
6.1 Research Performance
Para determinar si las AUC del test calculadas con los diferentes protocolos de trabajo, tenían o no diferencias estadísticamente significativas, se probaron las siguientes hipótesis e hicieron los respectivos cálculos según los métodos descritos por DeLong (22) recomendados cuando las curvas se derivan del mismo grupo de pacientes.
Hipótesis de trabajo.
Ho: El AUC del test de ELISA indirecta con el protocolo de Bionote = AUC del test de ELISA indirecta con el protocolo de Svanova 1:25= AUC del test trabajado con el protocolo In house Svanova 1:200.
Ha: Al menos una es diferente.
0 .0 0 0 .2 5 0 .5 0 0 .7 5 1 .0 0 0.00 0.25 1-especificidad0.50 0.75 1.00 Área bajo la Curva ROC = 0.8802
Ilustración 5. Curvas ROC del test con los diferentes protocolos de trabajo.
Visualmente, el test de ELISA indirecta trabajado con el protocolo de Bionote (Ilustración 5) tuvo la mayor AUC y ésta fue muy similar a la del test cuando se trabajó con el protocolo In house Svanova 1:200.
Tabla 6. Áreas bajo la curva ROC
Protocolo del test Área ROC Error Estándar IC 95%
Bionote 0,8896 0,0168 0,85674-0,92251
Svanova 1:25 0,8517 0,0198 0,81286-0,89059
In house Svanova 1:200 0,8802 0,0177 0,84555-0,91478
*Chi 2 (2)= 12,83 Prob. > Chi 2= 0,0016
Al menos una de las AUC del test trabajadas bajo con protocolo de Bionote, Svanova 1:25 e In house Svanova 1:200 es diferente (Nivel de Confianza 95%) (Tabla 6).
Para determinar en cuál o cuáles de las Áreas bajo la curva ROC se encontraban las diferencias se procedió a hacer una evaluación comparativa dos a dos.
0 .0 0 0 .2 5 0 .5 0 0 .7 5 1 .0 0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1-Especificidad
Área Curva ROC BIONOTE:0.8896 Área Curva ROC SVANOVA: 0.8517 Área curva ROC In House: 0.8802 Línea de Referencia
Hipótesis de trabajo:
Ho: El AUC del test de ELISA indirecta con el protocolo de Bionote = AUC del test de ELISA indirecta con el protocolo In house Svanova 1:200.
Ha: El AUC del test de ELISA indirecta con el protocolo de Bionote ≠ AUC del test de
ELISA indirecta con el protocolo In house Svanova 1:200.
Ilustración 6. Curvas ROC del test con el protocolo de Bionote y el con el protocolo In house Svanova 1:200 0 .0 0 0 .2 5 0 .5 0 0 .7 5 1 .0 0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1-Especificidad
Área bajo la Curva ROC In House: 0.8802 Área bajo la Cruva ROC SVANOVA: 0.8517 Línea de Referencia
Tabla 7. Comparación de AUC de la prueba con el protocolo de Bionote y con el protocolo In house Svanova 1:200
* Chi 2 (1)=0,66 Prob. > Chi 2= 0,4170
El AUC para el test de ELISA indirecta calculada a partir del protocolo de Bionote no
difiere estadísticamente del AUC calculada a partir del protocolo In house Svanova 1:200 (Nivel de Confianza 95%).
Hipótesis de trabajo:
Ho. AUC del test de ELISA indirecta calculada a partir del protocolo de Svanova 1:25= AUC del test de ELSA indirecta calculada a partir del protocolo In house Svanova 1:200.
Ha: AUC del test de ELISA indirecta calculada a partir del protocolo de Svanova 1:25≠
AUC del test de ELISA indirecta calculada a partir del protocolo In house Svanova 1:200.
Protocolo del test Área ROC Error estándar IC 95%
Bionote 0,8896 0,0168 0,85674-0,92251
Ilustración7. Curvas ROC del test calculadas con el protocolo In house Svanova 1:200 y con el protocolo Svanova 1:25
Tabla 8. Comparación de AUC del test calculadas con el protocolo de Svanova 1:25 y con el protocolo In house Svanova 1:200
Protocolo de Prueba diagnóstica
Área ROC Error Estándar IC 95%
Svanova 1:25 0,8517 0,0198 0,81286-0,89059
In house Svanova 1:200 0,8802 0,0177 0,84555-0,91478
*Chi 2 (1)=12,15 Prob > Chi 2= 0,0005
El AUC del test cuando se trabajó con el protocolo de Svanova 1:25 difiere estadísticamente del AUC del test cuando se trabajó con el protocolo In house Svanova 1:200 (IC 95%) (Tabla 8). 0 .0 0 0 .2 5 0 .5 0 0 .7 5 1 .0 0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1-Especificidad
Área bajo la Curva ROC In House: 0.8802 Área bajo la Cruva ROC SVANOVA: 0.8517 Línea de Referencia
5.4. Cálculo de la probabilidad pos prueba ante un resultado positivo para dos diferentes puntos de corte.
Para conocer la probabilidad de estar enfermo teniendo un resultado positivo del test de ELISA indirecta en presencia de diferentes prevalencias de hato se realizó el cálculo con diferentes prevalencias posibles de encontrar (Tabla 9).
Tabla 9. Probabilidad de enfermar si la prueba es positiva frente a diferentes prevalencias de hato o probabilidad preprueba
Prevalencia
Punto de corte≥30 Punto de corte ≥25
Protocolo Bionote Protocolo Svanova 1:25 Protocolo In house Svanova 1:200 Protocolo Bionote Protocolo Svanova 1:25 Protocolo In house Svanova 1:200 0,02 3,91% 3,86% 6,23% 3,86% 3,81% 5,23% 0,05 6,48% 6,40% 10,15% 6,39% 6,32% 8,59% 0,07 9,02% 8,91% 13,91% 8,90% 8,79% 11,84% 0,10 12,76% 12,61% 19,27% 12,61% 12,46% 16,55% 0,15 18,86% 18,65% 27,48% 18,64% 18,44% 23,95% 0,20 24,77% 24,52% 34,94% 24,51% 24,26% 30,86% 0,45 52,00% 52,00% 65,00% 52,00% 51,00% 61,00%
Dependiendo de la prevalencia de la enfermedad en el hato, la probabilidad posprueba de estar enfermo y tener un resultado positivo aumenta a medida que aumenta la probabilidad
preprueba (Tabla 9).
La probabilidad de estar enfermo si el test es positivo para diferentes prevalencias en un hato, es mayor cuando se trabajó con el protocolo In house Svanova 1:200 comparada con la calculada cuando se trabajó con el protocolo de Bionote o con el protocolo de Svanova 1:25. La disminución del punto de corte de ≥30 a ≥25, disminuyó la probabilidad pos prueba ante un resultado positivo (Tabla 9).
6. Discusión de resultados
Dentro del proceso de estandarización de la ELISA indirecta se debe determinar la combinación óptima del antígeno, el conjugado o el anticuerpo monoclonal, de tal forma que produzca una DO aproximada de 1.000 en diez minutos. Posteriormente se procede a realizar diferentes titulaciones con los sueros problema y los sueros controles (+ y -) con el propósito de determinar la dilución óptima que ofrezca el menor ruido de fondo posible (FP) y por lo tanto la mejor discriminación entre sueros positivos y los sueros negativos. Cuando se rompe este equilibrio, se afectan las características operativas del método medidas en términos de Se y Sp diagnóstica, Curva ROC y AUC (25).
En el proceso de formación del complejo inmune existen muchos factores bioquímicos que influencian la habilidad del anticuerpo para ligarse y permanecer ligado al antígeno como son la temperatura de la reacción, la fuerza iónica, el pH y las características del antígeno y del anticuerpo (26).
Las interacciones antígeno anticuerpo son reversibles y pueden ser dirigidas en cualquier sentido por manipulación en la concentración de reactantes. Por ejemplo una cierta concentración de anticuerpos podría causar aglutinación instantánea de células bacterianas; sin embargo, un nivel de anticuerpos mucho más alto o mucho más bajo podría no causar una aglutinación visible; esto es conocida como la zona de equivalencia. La zona de equivalencia representa el rango correcto de concentración de antígenos y anticuerpos para
causar las reacciones secundarias a que tendrán lugar. El antígeno y el anticuerpo se encuentran balanceados y la mayor parte del antígeno es aglutinado. Fuera de este rango las reacciones secundarias son menos marcadas y pueden no ser tan obvias dando reacciones falsas negativas en presencia de niveles muy altos de anticuerpos, fenómeno este conocido como prozona.
La prozona ocurre cuando las diluciones del suero son muy muy bajas, hay altas concentraciones de anticuerpos y aparentemente no ocurre la aglutinación. La prozona se puede presentar en inmunoensayos siendo menos marcada y frecuente en presencia de altos niveles de anticuerpos. En ELISA indirecta diluciones muy altas o muy bajas dan progresivamente lecturas de DO bajas y por lo tanto FP o FN.
El tiempo requerido para obtener el resultado en una ELISA puede ser disminuido por el aumento en la cantidad de reactantes, por el incremento en la temperatura y por agitación de los mismos para promover el contacto entre los reactantes. En general la interacción antígeno anticuerpo es una interacción química gobernada por las leyes de la química. Es así como la temperatura, el pH, las fuerzas iónicas, el tiempo, la concentración y los aspectos físicos de los reactantes se deben tener en cuenta al optimizar la reacción.
El sistema inmune de los mamíferos tiene la habilidad de reconocer características de superficie de macromoléculas o micromoléculas de los microorganismos patógenos. Este reconocimiento es normalmente específico y se realiza a través de moléculas de proteínas o anticuerpos que se ligan a las sustancias extrañas que estos reconocen denominados antígenos. La porción del antígeno a la cual se liga el anticuerpo es el determinante antigénico o epítope. El sitio específico de unión del anticuerpo con el antígeno que es complementario al epítope se denomina parátope (27). La multiespecificidad de las moléculas de anticuerpos les proporciona la habilidad para combinarse con gran variedad de epítopes con estructuras similares y depende no solamente de la heterogeneidad del epítope sino de la construcción molecular de los parátopes en la molécula de anticuerpos. La unión del antígeno anticuerpo se realiza por asociación no covalente que incluye fuerzas electrostáticas, puentes de hidrógeno, e interacciones de tipo Van der Waals y enlaces hidrofóbicos(28). Los enlaces iónicos y las fuerzas de Van del Waals son similares y representan atracción entre grupos químicos de cargas opuestas del antígeno y del anticuerpo. (26). Entonces los enlaces fuertes ocurren cuando el parátope coincide perfectamente con el epítope lo que se denomina enlace perfecto o el mejor enlace. La energía de enlace entre el anticuerpo y el antígeno se denomina afinidad. Los anticuerpos con paratopes que reconocen perfectamente los epítopes se llaman de alta afinidad para el antígeno; en cambio los anticuerpos con paratopes que reconocen epítopes de forma imperfecta se llaman de baja afinidad(27).
En el complejo antígeno anticuerpo la avidez se define como la suma promedio de todas las afinidades para todas las interacciones entre los anticuerpos que se encuentran en el suero y los varios sitios antigénicos o epítopes. Se aplica comúnmente a anticuerpos en el que los múltiples sitios de unión a un antígeno interactúan simultáneamente con los epítopes antigénicos de destino. La avidez se relaciona con la concentración de anticuerpos de alta y baja afinidad para un epítope específico. La avidez del suero puede cambiar cuando se cambia la dilución del mismo porque se diluyen las poblaciones de anticuerpos. Cuando se diluye el suero se afecta la concentración de los anticuerpos de alta y baja afinidad para el reconocimiento de epítopes específicos. Cuando el suero no es diluido en forma correcta, podemos tener competencia por los sitios antigénicos entre anticuerpos de alta y baja afinidad y los anticuerpos de alta afinidad podrían reaccionar en forma preferencial. Es así como en una dilución, la concentración de alta afinidad de anticuerpos podría estarse reduciendo hasta tener concentración de anticuerpos de baja afinidad. Entonces la dilución de un suero, puede afectar la habilidad para discriminar antígenos debido a la dinámica de la población de anticuerpos heterólogos (relativa concentración y afinidad de moléculas individuales de anticuerpos).
La sensibilidad diagnóstica del test bajo el protocolo In house Svanova 1:200 fue menor en comparación con la encontrada al trabajar con los otros protocolos, pero en forma global
presentó valores más altos de SP, VP+ y VP-. El aumento en la Se va en detrimento de la Sp
porque la prueba capta FP debido a la reactividad cruzada que se ocasiona por la producción de anticuerpos que se generan ante la presencia de bacterias Gram negativas en el huésped, bacterias que tienen estructuras similares a las cadenas O de polisacáridos de
B. abortus. Lo anterior es debido a que el epítope inmuno dominante del polisacárido O de
la Brucella es semejante a los epítopes de Yersinia enterocolitica O:9, Salmonella urbana
grupo N, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Escherichia coli O57, subtipo kaufman y
Stenotrophomonas maltophilia. La vacunación con cepas lisas de Brucella (17, 27) por
fuera del esquema de vacunación recomendado, también es causa de la persistencia de anticuerpos de origen vacunal que son captados por la prueba, dando resultados falsos positivos. Sin embargo, los parámetros de precisión de una ELISA pueden ser modificados en la medida en que se modifica el punto de corte y de acuerdo al objetivo de la prueba. (Requiere una prueba altamente sensible en programas de control o una prueba más específica a medida que avanzan a la eliminación y erradicación de una enfermedad).
La ELISA indirecta es usada como prueba tamiz para Brucelosis y los sueros positivos deben ser sujetos a confirmación con un test altamente específico, como es la ELISA Competitiva, que es capaz de distinguir anticuerpos producidos por infección de los anticuerpos producidos por vacunación o por exposición a bacterias con las que tiene reactividad cruzada(29).
7. Conclusiones.
La capacidad discriminativa de la ELISA indirecta trabajada con los protocolos de Svanova dilución 1:25, In house Svanova dilución 1:200 y Bionote dilución 1:50, es diferente.
No se pudo probar que la capacidad discriminativa de la prueba con el protocolo In house Svanova 1:200 y con el protocolo de Bionote dilución 1:50 difieran estadísticamente.
En la Curva ROC, el AUC de la ELISA indirecta, es menor cuando se trabaja con el protocolo de Svanova dilución 1:25 en comparación con el protocolo In house Svanova 1:200.
En el proceso de estandarización del método de ELISA indirecta, el hecho de determinar la combinación optima del antígeno, las características del antígeno y del anticuerpo, la combinación optima del conjugado o del anticuerpo monoclonal y tener control sobre los factores bioquímicos que influencian la habilidad del anticuerpo para ligarse y permanecer ligado al antígeno (la temperatura de la reacción, la fuerza iónica, el pH, el tiempo de incubación, el tiempo de revelado), trae como resultado una mejora en las características operativas del método. Cuando se rompe este equilibrio, la precisión diagnostica del método medida en términos de Curvas ROC y AUC se modifican.
Es necesario encontrar un balance entre la Se y la Sp de la prueba para el diagnóstico de la brucelosis para evitar que el incremento de la Se, aumente el número de FP y disminuya la Sp de la prueba.
El seguir las recomendaciones de los esquemas de vacunación diseñados para la cepa 19 evita la presencia de anticuerpos residuales de origen vacunal que son captados por la prueba y que contribuyen a aumentar los resultados FP de animales que deben ser diferenciados y confirmados por la ELISA Competitiva.
Al trabajar el test de ELISA indirecta con el protocolo In house Svanova 1:200 se obtiene en conjunto una mejor Se, Sp, valores predictivos y probabilidades posprueba ante un resultado positivo.
Para incrementar la Se del test de ELISA indirecta con el protocolo In house Svanova 1:200 se recomienda disminuir el punto de corte de ≥30 a ≥25.
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RESUMEN
El objetivo del estudio fue estimar las características operativas de la prueba ELISA indirecta para la detección de anticuerpos anti Brucella abortus en bovinos de Colombia
con tres protocolos: Svanova (en dilución del suero de trabajo 1:25, incubar * 10 minutos a temperatura ambiente 18-25º C), protocolo In house Svanova (dilución del suero de trabajo 1:200 incubar a 37º C * una hora según condiciones de estandarización y validación Mariño y colaboradores 1992, 1998) y Bionote (dilución 1:50, incubar * 15minutos a temperatura ambiente). Los kits comerciales de ELISA indirecta de Svanova y de Bionote se encuentran registrados y traen su propio protocolo de trabajo; sin embargo, el Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario trabaja el kit de Svanova de acuerdo al protocolo desarrollado en el laboratorio (In house).
La muestra fue seleccionada en forma retrospectiva del banco de sueros de diagnóstico serológico de brucelosis de 2013 de propiedad del Laboratorio Nacional de diagnóstico