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Para poder investigar las bases moleculares que gobiernan la interacción entre este GAGs y la Languerina primero se determinó la estructura tridimensional del hexasacárido libre (figura 3.3.1.1). Para ello, se analizaron los NOEs experimentales, 3

JHH y dinámicas moleculares. Conociendo la estructura tridimensional del ligando libre se conocería la influencia en la estructura del grupo sulfato adicional en la posición 4 de la GlcN del extremo no reductor. Para analizar si el grupo sulfato impedía la interacción con la Languerina empleando un ión Ca2+, se realizaron experimentos de STD para el hexasacárido en presencia de proteína con y sin iones Ca2+. Por último, se obtuvo una estructura del complejo mediante docking con la cual se realizó CORCEMA-ST para complementar las curvas de crecimiento del STD obtenidas de forma experimental con las obtenidas mediante CORCEMA-ST.

Los experimentos llevados a cabo para la caracterización del hexasacárido 4S en su forma libre fueron 2D-TOCSY y 2D-NOESY a 700 MHz en un espectrómetro Bruker Avance III. Para la realización de ellos se preparó una muestra de 300 µL de buffer Tris deuterado (150 mM de NaCl, 4 mM de CaCl2, 25 mM de d-Tris, pD 8) y 10 mM de EDTA para secuestrar los cationes divalentes. La concentración del ligando fue de 0.947 mM.

Figura 3.3.1.1 Representación de la estructura tridimensional del Hexasacárido 4S el cual presenta un grupo sulfato adicional en la posición 4 del extremo no reductor.

El experimento bidimensional NOESY a 300K refleja la conformación para los seis anillos que forman el hexasacárido 4S (figura 3.3.1.2). A partir de los anoméricos de los anillos de GlcN se observan los NOEs indicativos de una conformación 4C1. Los NOEs obtenidos para los anillos de IdoA tanto A como B y C son H2X/H5X siendo estos indicativos de la participación de la conformación 2SO en el equilibrio.

Figura 3.3.1.2 Espectro bidimensional NOESY de 500 ns obtenido a 300K y 700 MHz a partir de la muestra del Hexasacárido 4S con un exceso de EDTA a 32 escanes y 256

Para obtener datos cuantitativos acerca del equilibrio que presentan los anillos de Iduronato se han medido las constantes de acoplamiento a partir de experimentos 1D- COSY mediante la selección de los hidrógenos anoméricos y los que se encuentran en posición 5 de dichos anillos (tabla 3.3.1.1) debido a que se produce un gran solapamiento de señales. El grupo sulfato presente en el anillo del extremo no reductor no produce ningún cambio apreciable en el equilibrio conformacional, tal y como reflejan las constantes de acoplamiento ya que se observan valores muy parecidos entre los dos anillos de IdoA intermedios (C y E).

Pareja de átomos 3JHH IdoA_A 3JHH IdoA_C 3JHH IdoA_E

H1/H2 4.4 3.3 3.4

H2/H3 7.6 6.2 6.3

H3/H4 4.5 3.7 3.8

H4/H5 3.1 3.0 2.9

Tabla 3.3.1.1 Constantes de acoplamiento experimentales medidas a 298K para los 3 anillos de IdoA presentes en el hexasacárido.

Debido a que el análisis llevado a cabo mediante RMN reveló un equilibrio conformacional para los anillos de IdoA, este equilibrio se quiso contrastar con datos teóricos obtenidos de una simulación de dinámica molecular de 500 ns. Primero, de los resultados de la simulación obtenidos, se analizaron las coordenadas de plegamiento (θ y ϕ) para los 3 anillos de IdoA que mostraban el equilibrio conformacional (figura 3.3.1.3). En este caso se observa como para los diferentes anillos la conformación predominante es 1C4 algo que en principio parece contrario a lo expuesto anteriormente. Se debe destacar que la conformación de los anillos de IdoA con la que fue lanzada la DM fue 2SO para favorecer esa especie en el equilibrio. Anteriormente se lanzó otra DM desde una conformación 4C1 con resultado similar.

0 30 60 90 120 150 180 θ 0 100 200 300 400 500 Tiempo (ns) 0 30 60 90 120 150 180 θ 0 100 200 300 400 500 Tiempo (ns) IdoA_A IdoA_C

Figura 3.3.1.3 Representación de la coordenada θ para los tres anillos de IdoA presentes en el Hexasacárido 4S obtenidos de la DM libre a 500 ns.

De la simulación de la DM se midieron las constantes de acoplamiento teóricas. Como se obtuvo un equilibrio se midieron dos constantes, una para una conformación de silla y de bote torcido. Para medir la constante de acoplamiento de la coordenada del ecuador sólo se tuvieron en cuenta los valores de ϕ 150º ya que se calcularon todas las conformaciones que aparecen en la dinámica y son insignificativas comparadas con 2SO (tabla 3.3.1.2). Conformación 3S1 B1.4 5S1 2,5B 2SO B3,O ф 30 60 90 120 150 180 IdoA_A 3 1 1 4 84 6 IdoA_C 3 2 1 9 80 4 IdoA_E 0 1 1 8 86 3

Tabla 3.3.1.2 Tabla representativa de los porcentajes de las conformaciones del ecuador de la esfera de Cremer-Pople para el Hexasacárido 4S.

Cuando la conformación preferida para los anillos es 1C4 las constantes de acoplamiento son muy pequeñas mientras que si es 2SO son diferentes predominando valores intermedios y grandes. Si comparamos las 3JHH experimentales (tabla 3.3.1.3) y teóricas para las dos conformaciones obtenidas de la dinámica libre se observa que las experimentales muestran valores situados entre las dos conformaciones, volviendo a reflejar un equilibrio. Pareja de átomos 3_J HH dinámica libre 1_C 4 3_J HH dinámica libre 2_S O H1A/H2A 1.9 5.7 H2A/H3A 1.8 9.6 0 30 60 90 120 150 180 θ 0 100 200 300 400 500 Tiempo (ns) IdoA_E

H3A/H4A 2.4 5.2 H4A/H5A 1.3 3.7 H1C/H2C 1.8 5.1 H2C/H3C 2.2 10.1 H3C/H4C 2.5 6.4 H4C/H5C 1.5 4.1 H1E/H2E 1.7 5.3 H2E/H3E 2.9 9.9 H3E/H4E 2.8 4.2 H4E/H5E 1.3 4.0

Tabla 3.3.1.3 Constantes de acoplamiento teóricas medidas para las dos conformaciones del equilibrio que aparecen en la DM libre para el Hexasacárido 4S.

Se determinó el porcentaje para cada una de las conformaciones de los anillos de IdoA del hexasacárido en estado libre a partir de las constantes de acoplamiento. Para ello se llevó a cabo un ajuste lineal entre los valores de 3JHH experimentales y teóricos obteniendo así un 75% de 2SO y 26 de 1C4 para el anillo IdoA_A, 45 de de 2SO y 55 de 1

C4 para el IdoA_C y, por último, un 55% de 2

SO y 45 de 1

C4 para el IdoA_E. Esto indica un mayor porcentaje de 2SO para el anillo A mientras que el B y C muestran un equilibrio prácticamente del 50% en ambas conformaciones lo que no indica que se produzca algún efecto por el grupo SO3- del anillo vecino.