La utilización del HPLC-MS o MS/MS para analizar las toxinas lipofílicas en un programa de control, presenta numerosos inconvenientes. Algunos de ellos son compartidos con otras técnicas que incluyen la cromatografía pero otros derivan de la complejidad técnica de los equipos de espectrometría de masas. Los principales inconvenientes son los siguientes:
1.- Coste de los análisis.
El coste del equipamiento es muy elevado en el caso del uso de la espectrometría de masas de triple cuadrupolo o de alta resolución. Para un flujo alto de trabajo, como el que se lleva a cabo en programas de control de áreas de producción importantes, como Galicia por ejemplo, es necesario disponer como mínimo de dos equipos de HPLC-MS/MS, que en las gamas más básicas rondan, o incluso superan, en la actualidad los 200.000€ cada uno, lo que supone una inversión mínima de 400.000 € a lo que hay que añadir los costes de sistemas de alimentación ininterrumpida y de generación, conducción y regulación de gases, por lo que la inversión, fácilmente supera los 500.000 €.
Además del coste del equipamiento, los costes de mantenimiento y de los materiales necesarios para los análisis, hacen que esta técnica sea notablemente más cara que el bioensayo de ratón. En un proyecto de investigación reciente se han estimado los costes de diversas técnicas de análisis y se han obtenido los siguientes para un programa de control en el que se analicen 5.200 muestras/año, que es el número de análisis aproximado que se llevan a cabo en Galicia. Los costes se dan en la tabla que figura a continuación.
2. Complejidad del equipo que abre la posibilidad de que los problemas, cuando aparecen, no puedan ser resueltos en un plazo breve.
Los problemas que pueden tener estos equipos son muy diversos y pueden afectar de una forma sustancial al flujo de trabajo requerido en programas de control de zonas de producción importantes. Los problemas pueden ir desde interrupciones por causas menores (aumentos de presión de la columna, fallos en la inyección, fallos de software, etc.) hasta problemas importantes de la maquinaria o del software de los espectrómetros de masas.
La complejidad y el coste de estos equipos hacen que, aún con contratos de mantenimiento avanzado, existan reparaciones que no se puedan realizar en un tiempo breve. Son especialmente delicadas aquellas averías en las que los equipos no fallan de forma continua sino esporádicamente, lo cual las hace especialmente difíciles de diagnosticar y detectar y obligan a períodos de observación a veces prolongados. Adicionalmente, tras una avería importante, se hace necesario comprobar el correcto funcionamiento del equipo con una serie de pruebas que alargan nuevamente el período en el que el equipo no puede ser utilizado. Es, por tanto, relativamente probable que haya que mantener el equipo fuera de funcionamiento por períodos de una semana o incluso superiores. A estos períodos han de añadirse las tareas de mantenimiento periódico que, cuando requieren una limpieza en profundidad, difícilmente pueden llevarse a cabo sin un período de inactividad del equipo para el control de menos de dos días.
La necesidad de los espectrómetros de masas de contar, en una parte de su sistema, de alto vacío, supone que cualquier corte de suministro de energía eléctrica que no sea cubierto por suministro de emergencia y que supere la protección esperable por los sistemas de alimentación ininterrumpida (no más de 30 minutos), lleve a que se rompa el vacío y no se pueda restablecer el funcionamiento estable del equipo hasta que vuelva a generarse el alto vacío suficiente y además se estabilice, lo cual se considera habitualmente que requiere en torno a un día.
3. Imposibilidad de paralelizar las determinaciones.
Uno de los problemas que presenta está técnica para los programas de control intensivos, es la imposibilidad de llevar a cabo determinaciones en paralelo. Con técnicas como el bioensayo de ratón o el ensayo de inhibición de fosfatasas, es posible llevar a cabo la determinación de la toxicidad de varias muestras simultáneamente. En el caso de la técnica que nos ocupa, únicamente es posible analizar simultáneamente tantas muestras como equipos completos estén en funcionamiento en el laboratorio.
Como los equipos son caros y además requieren personal especializado para su manejo, es improbable que puedan realizarse más de dos muestras de forma simultánea, por lo que las muestras, básicamente se analizarán en serie, una detrás de otra. Esto supone, por un lado, un tiempo prolongado para poder disponer de los resultados de todos los análisis de un día y, por otro, una gran dificultad para adaptarse a situaciones
cambiantes que pueden requerir la realización en un día de un número considerablemente más alto de muestras que lo habitual. Tal puede ser el caso de momentos de alertas alimentarias relacionadas con población afectada por diarreas, decomisos de moluscos tóxicos provenientes de actividades irregulares, paralización de moluscos frescos en tránsito, etc.
4.- Imposibilidad o alto coste del control del correcto funcionamiento de los equipos en programas de control. Con una carga de muestras del orden de la actual en el programa de control de Galicia, la utilización de dos cromatógrafos con detector de espectrómetro de masas, para realizar el control, requeriría el funcionamiento de los equipos durante la noche, lo cual supone o bien que el correcto funcionamiento no se supervisará, o bien que será necesario contratar personal y habilitar un turno de trabajo de noche para ello.
Si se contrata personal su coste será elevado porque se necesitará más de una persona con experiencia en HPLC-MS/MS para cubrir el turno de noche. Si se opta por dejar los equipos sin atención, cualquier problema que interrumpa el funcionamiento de los equipos, que altere la calibración o la resolución del análisis o que cambie la sensibilidad del espectrómetro de masas, será detectado únicamente al día siguiente con lo cual los resultados de los análisis y las decisiones que depende de ellos habrán de retrasarse al día siguiente.
5. Problemas con efectos matriz tanto positivos como negativos.
Las determinaciones con este tipo de equipamiento, en general, detectan más o menos cantidad toxina de la que hay en realidad dependiendo de la muestra que se esté analizando (esto es lo que se conoce como efecto matriz). Muestras de diferentes especies de moluscos con la misma concentración de toxinas dan distintos resultados frecuentemente, pero además también pueden encontarse diferencias entre muestras de la misma especie por razón de su estado fisiológico, incluso, en ocasiones hemos encontrado diferencias entre la respuesta del mismo lote de moluscos antes y después de ser congelados. En nuestra experiencia este tipo de problemas en la cuantificación de las toxinas tienen causas muy diversas y, por ello son muy variables, no fácilmente previsibles y no pueden ser corregidos con métodos relativamente sencillos utilizados frecuentemente (uso de materiales de referencia que incluyan el bivalvo a analizar además de las toxinas, denominados habitualmente “matrix-matched reference materials”). Adicionalmente estos errores en la cuantificación de la concentración de toxinas, también dependen del método utilizado para el análisis y del equipamiento que se utilice incluyendo el tipo de espectrómetro de masas (marca/modelo comercial) y su modalidad de funcionamiento.
Durante el desarrollo de diversos estudios hemos encontrado tanto sobreestimaciones como subestimaciones sustanciales de las concentraciones reales de toxinas. Se ha dedicado últimamente un esfuerzo notable a la reducción o eliminación de este tipo de problemas y se han publicado algunas técnicas que tratan de minimizarlos, para especies de bivalvos determinadas y equipos también determinados, porque cada equipo se comporta de forma diferente, pero la incertidumbre inherente al análisis de bivalvos de especies no estudiadas en esos trabajos, a otras separaciones cromatográficas y a otros equipos, permanece. Esto supone que no debe ser infrecuente que laboratorios distintos estimen concentraciones distintas para la misma muestra incluso cuando las condiciones de conservación son muy similares.
La única forma de tratar de forma segura este problema, hoy por hoy, es medir directamente el efecto por medio de la cuantificación de la concentración en las muestras antes y después de añadir una cantidad conocida de toxina, o bien determinar las concentraciones en varias diluciones de las muestras. Esto, sin embargo, supone al menos duplicar o multiplicar el número de análisis a realizar y, por tanto casi duplicar el coste de los análisis que ya de por sí es elevado y alargar el tiempo del análisis.
6. Falta de muchos patrones y factores de toxicidad
Otro de los problemas del empleo de HPLC-MS/MS para la estimación de la toxicidad de las muestras es que esta ha de estimarse a partir de las concentraciones de las toxinas detectadas y cuantificadas individualmente. Esto presenta varias dificultades en el caso de diversas toxinas ya que pueden estar presentes en las muestras varias toxinas del mismo grupo (dentro del conjunto de las toxinas lipofílicas se engloban cuatro subgrupos: ácido okadaico + dinofisistoxinas, azaspirácidos, pectenotoxinas y yessotoxinas), algunas de las cuales pueden no detectarse (como en el caso de las yessotoxinas, que presentan numerosos derivados de naturaleza desconocida) y de otras puede no disponerse de patrones comerciales y certificados para su correcta cuantificación. En el caso de que algunas toxinas no se detecten, la toxicidad estimada puede ser inferior a la real (en grado dependiente de la concentración que tengan estas toxinas y a su toxicidad). En el caso de que no existan materiales de referencia certificados para alguna de las sustancias, como realmente sucede, la cuantificación de estas toxinas habrá de hacerse asumiendo que el equipo de detección responde a ellas como
a las toxinas del grupo para las que sí se dispone de patrones. Por ello, cualquier cambio de respuesta del equipo puede traducirse en estimaciones incorrectas de la concentración de las toxinas para las que no se dispone de materiales de referencia.
Adicionalmente, es necesario estimar la toxicidad de las muestras en función de las concentraciones de las distintas toxinas obtenidas, y esto depende de la potencia tóxica de cada compuesto y este dato no está disponible para todas las toxinas que se pueden encontrar en los bivalvos.
7.- Especialización del personal
El control oficial por medio de la metodología de HPLC-MS/MS, requiere personal técnico notablemente más especializado que en bioensayo de ratón y otros ensayos. Aunque la utilización de los equipos requeridos se ha simplificado mucho en los últimos años, siguen presentando un alto grado de complejidad que requiere una preparación exhaustiva para poder manejar y controlar su funcionamiento de forma fiable.
La propia complejidad de equipamiento requiere además una relación continua del personal encargado con el funcionamiento del equipo, ya que de lo contrario algunos aspectos del control de su funcionamiento pueden pasar desapercibidos. Estas características suponen que, por un lado, la contratación del personal sea más costosa y, por otro lado, y más importante aún para el funcionamiento de los programas de control, que resulte difícil sustituir al personal a cargo de los equipos en caso de bajas o períodos vacacionales.
1.4.3. Resumen del análisis de costes
Todas la cifras son euros/muestra.
DSP 100muestras/semana 20 muestras/mes