detectar estructuras vasculares positivas para Lyve-1 que co-expresen el marcador β-galactosidasa. Dichos resultados, además de confirmar el alto grado de recombinación inducido, evidencian que la expresión de CreERT2 se restringe mayoritariamente al endotelio vascular sanguíneo.
De la misma manera, el análisis de la expresión de β-galactosidasa y los marcadores CD31 y Lyve-1 en secciones histológicas de órganos de animales adultos tratados con tamoxifeno durante el desarrollo gestacional (5 mg a E10.5), evidencia que la expresión de β-galactosidasa se restringe mayoritariamente al endotelio vascular sanguíneo con escasa o nula expresión de dicho marcador en las células endoteliales de los vasos linfáticos (Figura 35). Estos resultados sugieren que, al menos durante esta etapa del desarrollo embrionario, la expresión de Tie2, y por tanto de CreERT2, es principalmente exclusiva del endotelio vascular sanguíneo, o bien que los niveles de expresión de dicho receptor en el endotelio vascular linfático son demasiado bajos como para inducir recombinación detectable.
Resultados
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2.2.6 Análisis de la recombinación en células del linaje hematopoyético
Diversos artículos destacan la expresión de Tie2 en distintos tipos de células hematopoyéticas (ver apartado 5.2.2 de Introducción). De hecho, los resultados obtenidos con algunos modelos transgénicos con expresión constitutiva de la recombinasa Cre bajo el control de secuencias del promotor de Tie2 indican que alrededor del 85% de las células hematopoyéticas adultas de la médula ósea proceden de células que expresan Tie2 en algún momento de su desarrollo (Tang et
al., 2010). Por ello se procedió a
analizar los niveles de recombinación detectados en células hematopoyéticas de la médula ósea y sangre periférica en animales sometidos a tratamiento con tamoxifeno durante la gestación o el desarrollo postnatal. Dadas las dificultades para la detección de β- galactosidasa mediante técnicas de citometría de flujo, el análisis de las poblaciones hematopoyéticas se realizó en animales homocigotos para Tie2CreERT2 que portan una copia del alelo trazador de la actividad de Cre Tg.CAG-LSL- Katushka (descrito en detalle en el apartado 4 de Resultados).
En primer lugar se analizó la recombinación inducida en células hematopoyéticas de médula ósea y sangre periférica de animales adultos sometidos a tratamiento con tamoxifeno (5 mg) a día E12.5 del desarrollo gestacional (Figura 36). Tanto en médula ósea como en sangre periférica un 0.5-0.8% de las células totales expresan niveles detectables de fluorescencia roja (Katushka) siendo la gran mayoría de ellas (~99%) células
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hematopoyéticas (CD45+). En lamédula ósea, aproximadamente el 88% de las células hematopoyéticas (CD45+) positivas para Katushka expresan a su vez el marcador de linaje mieloide CD11b. Por su parte, en la sangre periférica, el porcentaje de células CD45+ con expresión de Katushka que expresan el marcador mieloide CD11b es considerablemente inferior (~36%).
A continuación se analizó, en animales adultos, la recombinación inducida tras tratamiento con tamoxifeno durante el desarrollo postnatal temprano (50 µg de P1 a P3; Figura 37). En este caso la proporción de células de médula ósea y sangre periférica que expresan niveles detectables de Katushka es sensiblemente menor (alrededor de un 0.25%), tratándose la mayoría de ellas (~99%) de células hematopoyéticas (CD45+). En la médula ósea aproximadamente el 87% de las células positivas para Katushka expresan además de CD45 el marcador de linaje mieloide CD11b, mientras que en
la sangre periférica dicha población (Katushka+, CD45+, CD11b+) representa un 25% del total de células positivas para Katushka. En ambos casos los porcentajes son similares a los reportados para animales tratados durante el desarrollo gestacional, lo cual sugiere que, bajo las condiciones del presente análisis, no existen diferencias significativas en el patrón de expresión de Tie2 en células hematopoyéticas durante el desarrollo gestacional y postnatal.
Resultados
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Finalmente, se analizó la presencia de células positivas para Katushka en médula ósea y sangre periférica de ratones adultos tratados con tamoxifeno en la dieta durante ocho semanas (Figura 38). Dicho tratamiento no es capaz de inducir recombinación detectable en poblaciones hematopoyéticas, así pues, el perfil de expresión de Katushka es indistinguible entre animales portadores del alelo Tg.CAG- LSL-Katushka o de genotipo silvestre. Este resultado sugiere que en animales adultos la expresión de
Tie2 en células del linaje hematopoyético es inferior a la necesaria para dirigir niveles detectables de
recombinación mediados por Cre, al menos con el modelo generado y descrito en esta memoria.
2.2.7 Comparación con modelos transgénicos de recombinación inducible basados en Tie2
Si bien, el modelo Tie2CreERT2 descrito en esta tesis es el primer sistema de recombinación inducible en el endotelio vascular sanguíneo generado mediante gene targeting, existen otros modelos generados previamente mediante transgénesis convencional. Dos de ellos utilizan secuencias reguladoras de expresión del gen Tie2 para dirigir la expresión de CreERT2: uno, ampliamente utilizado en la literatura, a partir del promotor y primer intrón de Tie2 (Forde et al., 2002) y otro, desarrollado en paralelo a este trabajo, en el que la secuencia codificante de la recombinasa se introdujo en el primer codón codificante (ATG) del gen Tie2 contenido en un BAC (Korhonen et al., 2009). La disponibilidad del primero de estos modelos en nuestro laboratorio nos ha permitido establecer una comparación directa de su inducibilidad y especificidad con el sistema knockin descrito en este trabajo.
Con el objetivo de uniformizar al máximo las condiciones de inducción y análisis en la comparación de ambos modelos, se utilizaron animales hemicigotos y heterocigotos para los alelos transgénico Tg.Tie2-CreERT2 y knockin Tie2CreERT2, respectivamente, y heterocigotos para el alelo trazador
Rosa26LSLlacZ. A todos ellos se les administró dieta con tamoxifeno durante cinco u ocho semanas consecutivas y se analizó el nivel de recombinación mediante tinción X-gal en criosecciones o en preparación completa (Figura 39). Los resultados obtenidos indican que nuestro modelo
knockin induce la recombinación de manera más eficiente y con mayor especificidad por el
Resultados