11.1. Procedimientos generales
Para el fraccionamiento del extracto se utilizó cromatografía líquida al vacío (CLV) utilizando como fase estacionaria sílica gel 60 F254 SiliaPlateTM (5-20 µm). Las separaciones cromatográficas en la parte fitoquímica se realizaron por aplicación de presión mediante cromatografía flash (CF) utilizando sílica gel P60 SiliaFlash® (40-63 µm) como fase estacionaria. Los estudios cromatográficos, el monitoreo de las cromatografías líquida al vacío y flash se realizaron por cromatografía en capa delgada (CCD) empleando cromatoplacas de sílica gel 60 F254 SiliaPlateTM (5-20 µm), utilizando como reveladores vapores de yodo, luz UV (254 y 365 nm) y/o vainillina al 0,1% en H2SO4. Los solventes utilizados para las separaciones cromatográficas fueron adquiridos grado técnico y destilados antes de su uso.
Los compuestos aislados fueron elucidados mediante el empleo de técnicas espectroscópicas como RMN 1H, experimentos APT, COSY, HMQC y/o HMBC, y por comparación con los datos reportados en la literatura. Los espectros fueron tomados en un espectrómetro Bruker Avance AC-400, operado a 400 MHz. Se empleó cloroformo deuterado (CDCl3) como solvente a una temperatura de 25 °C. Los desplazamientos químicos (δ) están expresados en partes por millón (ppm) y las constantes de acoplamiento (J) en Hertz (Hz). Las multiplicidades están asignadas como s = singlete, d = doblete, t = triplete, c = cuarteto, dd = doble doblete, dt = doble triplete, m = multiplete, etc. Los datos de 13C, así como los tipos de carbonos para cada una de las moléculas elucidadas fueron obtenidos de los análisis de los experimentos APT.
La determinación tentativa de los constituyentes químicos de las mezclas se realizó empleando un cromatógrafo de gases Shimadzu GC 2010 Plus con un detector de masas Shimadzu TQ 8040, el cual fue operado a 70 eV, usando un analizador cuadrupolo, en modo full scan a 4,57 scan s-1. Los espectros de masas fueron adquiridos entre 40 y 400 m/z, y los análisis se realizaron con dos columnas de polaridad ortogonal (DB-5MS y HP-INNOWax). En el primer análisis de las mezclas se usó una columna DB-5MS (60 m x 0,25 mm x 0,25 µm) con inyección en modo Split (20:1) por 1,5 min. La rampa de temperatura comenzó en 40 °C durante 2 min, a continuación, se llevó hasta 123 °C (con un gradiente de 4 °C/min) y se mantuvo constante durante 2 min, en seguida se aumentó hasta 160 °C (4 °C/min) manteniéndola durante 5 min más. Posteriormente se aumentó hasta 220 °C (5 °C/min) y se mantuvo durante 8 min, y finalmente se llevó hasta 280 °C (5 °C/min) manteniéndola constante 4 min, para un tiempo total de corrida de 75 min. En el segundo análisis se empleó una columna HP-INNOWax (60 m x 0,25 mm x 0,25 µm) con inyección en modo Split (20:1) por 1,5 min. La rampa de temperatura comenzó en 45 °C durante 4 min, luego se aumentó hasta 120 °C (3 °C/min) manteniéndola durante 2 min y finalmente se llevó hasta 250 °C (4 °C/min)
manteniéndola constante 8 min, para un tiempo total de 71,5 min.
11.2.
Estudio fitoquímico sobre la especie P. bogotense.
11.2.1.
Colecta material vegetal
La parte aérea de Piper bogotense fue recolectada en los alrededores del parque Nacional de la ciudad Bogotá D. C. La muestra fue determinada preliminarmente por el grupo de Investigación y un espécimen fue enviado al Herbario de la Universidad de Antioquia (HUA) para su clasificación.
11.2.2.
Extracción y fraccionamiento realizada sobre la parte aérea P.
bogotense
La parte aérea seca y molida de P. bogotense (1000 g) fue sometida a extracción con etanol al 96% utilizando el método de maceración a temperatura ambiente. La solución resultante fue concentrada por destilación a presión reducida para obtener 458 g de extracto etanólico. Una parte del extracto (150 g) fue fraccionada por cromatografía líquida al vacío (CLV) empleando solventes de diferente polaridad: diclorometano (DCM), acetato de etilo (AcOEt), Isopropanol (IPA) y mezcla de etanol-agua (EtOH-H2O) (80:20). Después de la evaporación de los solventes a presión reducida se obtuvieron las fracciones DCM (40,4 g), AcOEt (20,5 g), IPA (14,0 g) y EtOH-H2O (15,0 g). En la
Figura 12 se ilustra el esquema general de extracción y fraccionamiento realizado sobre P.
bogotense.
11.2.3. Ensayos cualitativos por difusión en agar frente a Pseudomonas
aeruginosa y Chromobacterium violaceum
11.2.3.1. Ensayo cualitativo por difusión en agar frente a Pseudomonas
aeruginosa (ATCC BAA047)
La actividad antibacteriana cualitativa del extracto y de las fracciones sobre P. aeruginosa se determinó mediante el ensayo cualitativo por difusión en agar modificado (Bauer,et al 1966). En un ensayo típico, se sembró el medio Müller-Hinton (37 g/L H2O) en cajas de Petri, luego de que se solidificó se perforaron pozos de 5 mm de diámetro y se sembraron 10 μL de soluciones de las sustancias a concentraciones de 30 mg/mL. Posteriormente, se sembró la bacteria usando la técnica siembra por agotamiento en estría, enseguida, se llevó a incubación a 37 °C. Transcurridas 18 h se midieron los diámetros de los halos de inhibición presentes en los pozos, que fueron expresados en milímetros. Se realizaron 3 repeticiones, se utilizó como control negativo DMSO y como control positivo gentamicina (2 mg/mL).
11.2.3.2. Ensayo cualitativo por difusión en agar frente a Chromobacterium
violaceum (ATCC 12472)
La actividad sobre la producción de violaceína cualitativa del extracto y de las fracciones se determinó mediante el ensayo cualitativo por difusión en agar modificado (Bauer,et al 1966) utilizando como bacteria a C. violaceum; En un ensayo típico, se sembró el medio Luria Bertani (LB) (20 g/L H2O) en cajas de Petri, se solidificó y se perforaron pozos de 5 mm de diámetro. Se sembraron 10 μL de soluciones de las fracciones a concentraciones de 30 mg/mL en cada uno de los pozos, se sembró la bacteria usando la técnica de siembra por agotamiento en estría y luego se llevaron a incubación a 30 °C. Transcurridas 18 h se midieron los diámetros de los halos de pigmentación presentes en los pozos, que fueron expresados en milímetros. Se realizaron 3 repeticiones, se utilizó como control negativo DMSO y gentamicina a 2 mg/mL como control de inhibición.
11.2.4.
Purificación de la fracción de DCM proveniente de P. bogotense
La fracción de DCM (40,4 g) se sometió a cromatografía flash (CF) eluyendo con una mezcla de hexano: AcOEt en polaridad creciente (95:5 a 50:50), obteniéndose 75 fracciones que fueron reunidas en 4 fracciones finales de acuerdo con el estudio por CCD. La fracción 1, llamada mezcla
M1, por su complejidad fue sometida a análisis por CG-EM. La fracción 2 (15,6 g) se sometió a
purificación mediante repetidas CF eluyendo con mezcla de hexano: AcOEt (97:3), hexano: acetona (80:20) y hexano: AcOEt (70:30), de donde se obtuvo un sólido blanco cristalino correspondiente al ácido 4-metoxi-3-farnesilbenzoico C-1 (500,2 mg). La fracción 3 (3,6 g) fue sometida a CF sucesivas con mezcla de hexano: AcOEt (95:5) y DCM: AcOEt (80:20), obteniéndose un sólido verde opaco correspondiente al ácido 4-hidroxi-3-farnesilbenzoico C-2 (70,5 mg). La fracción 4 (1,8 g) fue fraccionada repetitivamente mediante CF sucesivas con mezcla de DCM: AcOEt: Acetona (60:30:10), Hexano: MEK (80:20), Hexano:CHCl3 (60:40) y Hexano: AcOEt (70:30), obteniéndose un sólido blanco
correspondiente al ácido 4-hidroxi-3-farnesilbenzoico C-3 (18,0 mg). En la Figura 13 se muestra el esquema de purificación de la fracción de DCM.
Figura 13. Esquema general de purificación de los metabolitos secundarios presentes en la fracción
de DCM proveniente de P. bogotense
11.3.
Evaluación de actividad antibacteriana frente a Pseudomonas
aeruginosa y Chromobacterium violaceum de los compuestos aislados
e identificados de P. bogotense.
11.3.1. Microorganismos y Mantenimiento
Para la evaluación de la actividad se adquirieron cepas de P. aeruginosa (ATCC BAA047) y C. violaceum (ATCC 12472) disponibles comercialmente por ATCC labs e importadas por DIzarLtda en Colombia . Para la conservación a largo plazo de las de las cepas se empleó como método la congelación a -70°C inmersas en Caldo LB con glicerol al 10%. Para el método de conservación a corto plazo, se realizó una resiembra de la cepa madre, utilizando medio Muller-Hilton, la cual cumplió la función de cepa de trabajo y de allí partir para realizar los ensayos.
11.3.2. Ensayo de susceptibilidad
La actividad de compuestos aislados e identificados se determinó mediante el ensayo de susceptibilidad utilizando como bacteria P. aeruginosa, para ello, se preparó una suspensión bacteriana en caldo o solución salina, y fue ajustada a una turbidez de 0.5 de la escala Mc Farland equivalente a 1x108 UFC/mL. Posteriormente se toma una placa de 96 pozos y se adicionó el inóculo
que permitió obtener una concentración final de 1x104 UFC/mL; se adicionaron los compuestos a una concentración de 200, 100, 50, 25 y 12,5 ppm. Transcurridas 24 h de incubación a 37 °C, se midió la absorbancia en un lector de placas a una longitud de onda de 600 nm. El ensayo se realizó por triplicado y se empleó como control positivo gentamicina (2 ppm), como control negativo DMSO puro (solvente en el que se disuelve el tratamiento), control de los extractos, control de crecimiento y control del medio.
11.3.3. Ensayo de inhibición QS- cuantificación violaceína
La inhibición de QS a compuestos aislados e identificados se determinó mediante el ensayo de cuantificación de violaceína utilizando a C. violaceum como bacteria bioindicadora, para ello, se preparó una suspensión bacteriana en caldo o solución salina, y se ajustó a una turbidez de 0.5 de la escala Mc Farland equivalente a 1x108 UFC/mL; En una placa de 96 pozos se inoculó la bacteria en caldo Luria Bertani (LB) que contenía los compuestos a una concentración de 200, 100, 50, 25, 12,5 ppm. Se incubó por 24 h a 30 °C. Pasado este tiempo se centrifugó una alícuota del cultivo a 15000 rpm por 10 minutos separando las células. Se descartó el sobrenadante y se adicionaron 250 uL de DSMO. Posteriormente, se realizó vortéx para solubilizar el pigmento, y se volvió a centrifugar a 15000 rpm por 10 minutos. Del sobrenadante se tomó un volumen de 200 uL y se leyó su absorbancia a 585 nm, usando un lector de microplacas. Se empleó como control positivo gentamicina (2 ppm), como control negativo DMSO puro (solvente en el que se disuelve el tratamiento), control de los extractos, control de crecimiento y control del medio. El ensayo se realizó por triplicado y el resultado se muestra como porcentaje de inhibición de violaceína.