Retrieving All Breakpoints

Este propuesta estuvo enmarcada dentro de la necesidad de ampliar el conocimiento  acerca de la contribución de las bacterias AAP a los flujos de carbono dentro de los  sistemas  acuáticos.  Considerando  que  su  función  fotoheterótrofa  representa  una  entrada  alternativa  de  energía  a  los  sistemas;  que  puede  modificar  la  cantidad  y  la  velocidad a la que se transfiere el carbono hacia otros eslabones de la red trófica; y  que  por  estudios  a  nivel  fisiológico  se  conoce  que  las  bacterias  AAP  regulan  la  expresión  del  pigmento  fotosintético  en  diferentes  condiciones  de  cultivo;  nosotros  planteamos la hipótesis que sostiene que la ocurrencia de la función fotoheterótrofa  de  las  AAP  en  sistemas  naturales  varía  de  acuerdo  a  la  concentración  de  carbono  orgánico y nutrientes disueltos, la disponibilidad de luz y saturación de oxígeno.  Para  ponerla a prueba nosotros propusimos una métrica que da cuenta sobre la Expresión 

de la fototrofía de las poblaciones de AAP in situ; a través de la relación de abundancia 

relativa de células AAP, cuantificadas por puf M‐ qPCR y la abundancia de AAP que  sintetizan  el  pigmento  fotosintético,  cuantificadas  por  microscopía  de  epifluorescencia infrarroja; en diferentes lagos de Quebec, Canadá. 

Previo a la estimación de la abundancia de AAP por PCR cuantitativa, la técnica fue  validada para establecer las mejores condiciones de amplificación y cuantificación del  gen  puf  M.  La  selección  de  los  cebadores  estuvo  basada  en  la  evaluación  de  oligonucleótidos  reportados  previamente,  bajo  los  criterios  de  cobertura,  especificidad y las propiedades fisicoquímicas de los primers. De esta evaluación los  

primers  puf  M  forward  y  puf  M  WAW  reverse,  cumplieron  con  el  conjunto  de 

requerimientos para ser usados en las cuantificaciones del gen puf M. Sin embargo,  algunas  estimaciones  de  AAP  por  microscopía  epiflurescencia  infrarroja  fueron  mayores  a  las  arrojadas  por  qPCR.  Estos  resultados  sugieren  una  limitación  de  cobertura  de  los  cebadores  usados  y  por  lo  tanto  posibles  subestimaciones  del  gen 

puf M de AAP en los sistemas estudiados. Esta limitación podría sobrellevarse con un 

análisis  más  exhaustivo  de  la  diversidad  del  gen  puf  M  de  AAP  en  agua  dulce  y  el  diseño y posterior uso de cebadores que amplíen el espectro de las secuencias que  pueden ser amplificadas y cuantificadas por qPCR. 

Uno  de  los  problemas  más  comunes  en  el  uso  de  la  qPCR  como  técnica  de  cuantificación  de  genes  en  Ecología  Microbiana,  está  relacionado  con  las  bajas  eficiencias  de  amplificación  asociadas  a  fenómenos  de  inhibición.  Nosotros  observamos  que  esta  inhibición  puede  ser  provocada  por  altas  cantidades  de  DNA 

template  y  la  concentración  de  primers  usados  en  la  reacción  de  amplificación.  De 

esta  manera,  los  fenómenos  de  inhibición  en  nuestras  amplificaciones  fueron  controlados usando una concentración de primers de 0.12 uM y hasta 9 ng de DNA  por  reacción.  Después  de  tener  las  condiciones  de  corrida  puestas  a  punto,  se  construyó una curva estándar para la cuantificación del gen puf M en los extractos de  DNA  ambiental,  que  incluyó  números  de  copias  conocidas  del  gen.  Así,  la  fase  de  validación  de  la  PCR  cuantitativa  culminó  tras  probar  la  linealidad  de  la  curva, 

obteniendo  altos  porcentajes  de  eficiencia  de  amplificación  y  ausencia  de  señal  de  amplificación para el control negativo y picos de disociación secundarios. 

La  estimación  de  la  Expresión  de  la  fototrofía  de  las  poblaciones  de  AAP  de  los  diferentes lagos y el análisis de correlación de ésta métrica con las variables carbono  orgánico  y  nutrientes  disueltos,  coeficiente  de  extinción  de  luz  y  porcentaje  de  saturación de oxígeno, permiten corroborar nuestra hipótesis inicial y concluir que la  ocurrencia de la función fotoheterótrofa de las AAP in situ varía de un lago a otro. El  análisis mostró, que la Expresión de la fototrofía de las poblaciones de AAP tiende a ser  mayor en sistemas con coeficientes de extinción de luz más altos y menor saturación  de  oxígeno.  Este  resultado  es  consistente  con  estudios  in  vitro  desarrollados  previamente;  en  los  que  se  demostró  que  las  AAP  inhiben  la  síntesis  de  bacterioclorofila a después de cambiar las condiciones de incubación de oscuridad a  luz. Sin embargo, sigue siendo un interrogante la utilidad de mantener la síntesis del  pigmento  fotosintético  en  sistemas  naturales  donde  luz  es  un  recurso  limitado  permanentemente.  

Este  trabajo  presenta  una  forma  diferente  de  aproximarse  al  estudio  de  las  poblaciones  de  AAP  que  podría  generar  nueva  información  sobre  los  factores  asociados a la expresión de la función fotoheterótrofa de estas bacterias en sistemas  naturales.  No  obstante,  el  conocimiento  de  los  fenómenos  de  regulación  de  esta  función  aún  es  limitado  y  por  lo  tanto,  es  preciso  continuar  en  una  línea  de  investigación conjunta de estudios in vitro e in situ que amplíen la información sobre  los factores que afectan la síntesis del pigmento fotosintético de este grupo funcional.   

Bibliografía 

1.  Shiba,  T.,  Simidu,  U.  &  Taga,  N.  Distribution  of  Aerobic  Bacteria  Which  Contain  Bacteriochlorophyll  a.  Appl.  Environ.  Microbiol.  43–45  (1979).  at  <http://aem.asm.org/content/38/1/43.short> 

2.  Koblízek, M. et al. Isolation and characterization of Erythrobacter sp. strains from the  upper ocean. Arch. Microbiol. 180, 327–38 (2003). 

3.  Kolber,  Z.  S.,  Van  Dover,  C.  L.,  Niederman,  R.  &  Falkowski,  P.  G.  Bacterial  photosynthesis in surface waters of the open ocean. Nature 407, 177–9 (2000). 

4.  Gasol,  J.  et  al.  Towards  a  better  understanding  of  microbial  carbon  flux  in  the  sea*. 

Aquat. Microb. Ecol. 53, 21–38 (2008).  5.  Yurkov, V. V. & Csotonyi, J. T. New light on aerobic anoxygenic phototrophs. (2009). at  <http://link.springer.com/chapter/10.1007/978‐1‐4020‐8815‐5_3>  6.  Kolber, Z. S. et al.  Contribution of aerobic photoheterotrophic bacteria to the carbon  cycle in the ocean. Science 292, 2492–5 (2001).  7.  Yurkov, V. & Csotonyi, J. T. Chapter 3 New Light on Aerobic Anoxygenic Phototrophs.  (2009).  8.  Biebl, H. & Wagner‐do, I. Growth and bacteriochlorophyll a formation in taxonomically  diverse  aerobic  anoxygenic  phototrophic  bacteria  in  chemostat  culture :  Influence  of  light regimen and starvation. 41, 2153–2159 (2006). 

9.  Cottrell,  M.  T.  &  Kirchman,  D.  L.  Photoheterotrophic  microbes  in  the  Arctic  Ocean  in  summer and winter. Appl. Environ. Microbiol. 75, 4958–66 (2009). 

10.  Schwalbach,  M.  S.  &  Fuhrman,  J.  A.  Wide‐ranging  abundances  of  aerobic  anoxygenic  phototrophic bacteria in the world ocean revealed by epifluorescence microscopy and  quantitative PCR. 50, 620–628 (2005). 

11.  Azam, F., Fenchel, T. & Field, J. G. The ecological role of water‐column microbes in the 

sea.  Mar.  Ecol.  …  257–263  (1983).  at 

<http://www.soest.hawaii.edu/oceanography/courses/OCN621/Spring2011/Azam  et al_loop.pdf> 

12.  Pomeroy,  L.  &  Wiebe,  W.  Energetics  of  microbial  food  webs.  Hydrobiologia  18,  7–18  (1988). 

13.  Fenchel,  T.  The  microbial  loop  –  25  years  later.  J.  Exp.  Mar.  Bio.  Ecol.  366,  99–103  (2008). 

14.  Waidner, L. A. & Kirchman, D. L. Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria attached to  particles  in  turbid  waters  of  the  Delaware  and  Chesapeake  estuaries.  Appl.  Environ. 

Microbiol. 73, 3936–44 (2007). 

15.  Lami, R. et al. High abundances of aerobic anoxygenic photosynthetic bacteria in the  South Pacific Ocean. Appl. Environ. Microbiol. 73, 4198–205 (2007). 

16.  Lehours,  A.  C.,  Cottrell,  M.  T.,  Dahan,  O.,  Kirchman,  D.  L.  &  Jeanthon,  C.  Summer  distribution  and  diversity  of  aerobic  anoxygenic  phototrophic  bacteria  in  the  Mediterranean  Sea  in  relation  to  environmental  variables.  FEMS  Microbiol.  Ecol.  74,  397–409 (2010). 

17.  Du, H., Jiao, N., Hu, Y. & Zeng, Y. Real‐time PCR for quantification of aerobic anoxygenic  phototrophic  bacteria  based  on  pufM  gene  in  marine  environment.  J.  Exp.  Mar.  Bio. 

Ecol. 329, 113–121 (2006). 

18.  Béjà,  O.  Bacterial  Rhodopsin:  Evidence  for  a  New  Type  of  Phototrophy  in  the  Sea. 

Science (80‐. ). 289, 1902–1906 (2000). 

19.  Rathgeber, C., Beatty, J. T. & Yurkov, V. V. Aerobic phototrophic bacteria : new evidence  for  the  diversity  ,  ecological  importance  and  applied  potential  of  this  previously  overlooked group. 113–128 (2004). 

20.  Yurkov, V. V. & Beatty, J. T. Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria. Microbiol. Mol. 

Biol. Rev. 62, 695–724 (1998). 

21.  Yurkov, V. V. & Schoepp, B. Photoinduced electron transfer and cytochrome content in  obligate  aerobic  phototrophic  bacteria  from  genera  Erythromicrobium  ,.  117–128  (1997). 

22.  Béjà,  O.  et al.  Unsuspected  diversity  among  marine  aerobic  anoxygenic  phototrophs. 

Nature 415, 630–3 (2002). 

23.  Nishimura,  K.  et  al.  Expression  of  the  puf  operon  in  an  aerobic  photosynthetic  bacterium, Roseobacter denitrificans. Plant Cell Physiol. 37, 153–9 (1996). 

24.  Kortlüke, C., Breese, K., Gad’on, N., Labahn, A. & Drews, G. Structure of the puf operon  of the obligately aerobic, bacteriochlorophyll alpha‐containing bacterium Roseobacter  denitrificans OCh114 and its expression in a Rhodobacter capsulatus puf puc deletion  mutant. J. Bacteriol. 179, 5247–58 (1997). 

25.  Ouchane,  S.,  Steunou,  A.‐S.,  Picaud,  M.  &  Astier,  C.  Aerobic  and  anaerobic  Mg‐ protoporphyrin monomethyl ester cyclases in purple bacteria: a strategy adopted to  bypass the repressive oxygen control system. J. Biol. Chem. 279, 6385–94 (2004).  26.  Suyama,  T.  &  Shigematsu,  T.  Photosynthetic  apparatus  in  Roseateles  depolymerans 

61A  is  transcriptionally  induced  by  carbon  limitation.  Appl.  …  1665–1673  (2002).  doi:10.1128/AEM.68.4.1665 

27.  Goericke, R. Bacteriochlorophyll a in the ocean: Is anoxygenic bacterial photosynthesis  important? Limnol. Oceanogr. 47, 290–295 (2002). 

28.  Spring,  S.  &  Riedel,  T.  Mixotrophic  growth  of  bacteriochlorophyll  a‐containing  members  of  the  OM60/NOR5  clade  of  marine  gammaproteobacteria  is  carbon‐ starvation  independent  and  correlates  with  the  type  of  carbon  source  and  oxygen  availability. BMC Microbiol. 13, 117 (2013). 

29.  Masín,  M.,  Nedoma,  J.,  Pechar,  L.  &  Koblízek,  M.  Distribution  of  aerobic  anoxygenic  phototrophs  in  temperate  freshwater  systems.  Environ.  Microbiol.  10,  1988–96  (2008). 

30.  Yutin,  N.  et  al.  Assessing  diversity  and  biogeography  of  aerobic  anoxygenic  phototrophic  bacteria  in  surface  waters  of  the  Atlantic  and  Pacific  Oceans  using  the  Global  Ocean  Sampling  expedition  metagenomes.  Environ.  Microbiol.  9,  1464–75  (2007). 

31.  Cottrell, M. T. Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria in the Mid‐Atlantic Bight and  the North Pacific Gyre. Appl. Environ. … 557–564 (2006). doi:10.1128/AEM.72.1.557  32.  Zhang, Y. & Jiao, N. Dynamics of aerobic anoxygenic phototrophic bacteria in the East 

China Sea. FEMS Microbiol. Ecol. 61, 459–69 (2007). 

33.  Lamy,  D.  et  al.  Ecology  of  aerobic  anoxygenic  phototrophic  bacteria  along  an  oligotrophic gradient in the Mediterranean Sea. Biogeosciences 8, 973–985 (2011).  34.  Salka,  I.  et  al.  Abundance,  depth  distribution,  and  composition  of  aerobic 

bacteriochlorophyll a‐producing bacteria in four basins of the central Baltic Sea. Appl. 

Environ. Microbiol. 74, 4398–404 (2008). 

35.  Jiao,  N.  et  al.  Distinct  distribution  pattern  of  abundance  and  diversity  of  aerobic  anoxygenic  phototrophic  bacteria  in  the  global  ocean.  Environ.  Microbiol.  9,  3091–9  (2007). 

36.  Du, H., Jiao, N., Hu, Y. & Zeng, Y. Real‐time PCR for quantification of aerobic anoxygenic  phototrophic  bacteria  based  on  pufM  gene  in  marine  environment.  J.  Exp.  Mar.  Bio. 

Ecol. 329, 113–121 (2006). 

37.  Koblízek, M., Stoń‐Egiert, J., Sagan, S. & Kolber, Z. S. Diel changes in bacteriochlorophyll  a  concentration  suggest  rapid  bacterioplankton  cycling  in  the  Baltic  Sea.  FEMS 

Microbiol. Ecol. 51, 353–61 (2005). 

38.  Waidner, L. A. & Kirchman, D. L. Diversity and distribution of ecotypes of the aerobic  anoxygenic phototrophy gene pufM in the Delaware estuary. Appl. Environ. Microbiol.  74, 4012–21 (2008). 

39.  Smith,  C.  J.  &  Osborn,  a  M.  Advantages  and  limitations  of  quantitative  PCR  (Q‐PCR)‐ based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 6–20 (2009). 

40.  Rastogi,  G.  &  Sani,  R.  K.  Molecular  Techniques  to  Assess  Microbial  Community  Structure,  Function,  and  Dynamics  in  the  Environment.  Microbes  Microb.  Technol. 

Agric. Environ. Appl. 29–58 (2011). doi:10.1007/978‐1‐4419‐7931‐5 

41.  Bustin,  S.  .  et  al.  The  MIQE  guidelines:  minimum  information  for  publication  of  quantitative real‐time PCR experiments. Clin. Chem. 55, 611–22 (2009). 

42.  Quellhorst, G. & Rulli, S. TECHNICAL ARTICLE A Systematic Guideline for Developing  the  Best  Real‐Time  PCR  Primers  What  we  have  learned  from  designing  assays  for  more than 14 , 000 genes. Gene 5, 1–8 (2008). 

43.  Budinoff,  C.  Molecular  Techniques  for  Microbial  Ecology :  A  Compilation  of  Reviews.  (2007).  44.  Kepner, R. & Pratt, J. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in  environmental samples: past and present. Microbiol. Rev. 58, (1994).  45.  Nagashima, K. V., Hiraishi, A., Shimada, K. & Matsuura, K. Horizontal transfer of genes  coding for the photosynthetic reaction centers of purple bacteria. J. Mol. Evol. 45, 131– 6 (1997).  46.  Achenbach, L. A., Carey, J. & Madigan, M. T. Photosynthetic and phylogenetic primers  for  detection  of  anoxygenic  phototrophs  in  natural  environments.  Appl.  Environ. 

Microbiol. 2922–2927 (2001). doi:10.1128/AEM.67.7.2922 

47.  Yutin, N., Suzuki, M. T. & Béjà, O. Novel primers reveal wider diversity among marine  aerobic  anoxygenic  phototrophs.  Appl.  Environ.  Microbiol.  8958–8962  (2005).  doi:10.1128/AEM.71.12.8958 

48.  King,  C.,  Debruyne,  R.,  Kuch,  M.,  Schwarz,  C.  &  Poinar,  H.  A  quantitative  approach  to  detect and overcome PCR inhibition in ancient DNA extracts. Biotechniques 47, 941–9  (2009). 

49.  Biosystems,  A.  Creating  Standard  Curves  with  Genomic  DNA  or  Plasmid  DNA  Templates for Use in Quantitative PCR. F Hoffmann‐La Roche Ltd Basel 1–8 (2013). at  <http://scholar.google.com/scholar?hl=en&btnG=Search&q=intitle:Creating+Standar d+Curves+with+Genomic+DNA+or+Plasmid+DNA+Templates+for+Use+in+Quantitati ve+PCR#1> 

50.  Oh,  H.  M.,  Giovannoni,  S.,  Ferriera,  S.,  Johnson,  J.  &  Cho,  J.‐C.  Complete  genome  sequence of Erythrobacter litoralis HTCC2594. J. Bacteriol. 191, 2419–20 (2009).  51.  Hu, Y., Du, H., Jiao, N. & Zeng, Y. Abundant presence of the gamma‐like Proteobacterial 

pufM gene in oxic seawater. FEMS Microbiol. Lett. 263, 200–6 (2006). 

52.  Jiang, H. et al. Abundance and diversity of aerobic anoxygenic phototrophic bacteria in  saline lakes on the Tibetan plateau. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 268–78 (2009). 

53.  Button, D. K. & Robertson, B. R. Determination of DNA Content of Aquatic Bacteria by  Flow Cytometry. Appl. Environ. … 67, (2001). 

54.  Fauteux, L., Cottrel, M. ., Kirchman, D. L. & del Giorgio, P. Temporal and spatial patterns  in the abundance and cell‐size of AAP bacterial in temperate and boreal lakes. Environ. 

Microbiol. 

55.  Eiler,  A.,  Beier,  S.  &  Sa,  C.  High  Ratio  of  Bacteriochlorophyll  Biosynthesis  Genes  to  Chlorophyll  Biosynthesis  Genes  in  Bacteria  of  Humic  Lakes.  Appl. Environ. Microbiol.  7221–7228 (2009). doi:10.1128/AEM.00960‐09 

56.  Salka,  I.,  Cuperová,  Z.,  Mašín,  M.,  Koblízek,  M.  &  Grossart,  H.  P.  Rhodoferax‐related  pufM  gene  cluster  dominates  the  aerobic  anoxygenic  phototrophic  communities  in  German freshwater lakes. Environ. Microbiol. 13, 2865–75 (2011).  

57.  Wetzel, R.G. Limnology. Second Edition. Editorial: CBS College Publishing. (1983).  58.  Roldan,  G.  &  Restrepo,  J.J.  Fundamentos  de  limnología  Neotropical.  Segunda  Edición. 

para la cuantificación de AAP en lagos 

  puf M 557 F  puf M uni F  _Forward puf M   puf M 750 R  puf M uni R  puf M  WAW 

puf M 557  F      NA        NA  NA        puf M uni  F        NA        NA      No  complementarie dad en extremos  3’  puf M   Forward      NA      NA  NA      No  complementarie dad en extremos  3’