S (2000) Int J Dev Biol 44, 361-

6. Augustine, K. A., Silbiger, S. M., Bucay, N., Ulias, L., Boynton, A., Trebasky, L. D., and Medlock, E. S. (2000) Anat. Rec. 258, 221-234

7. Ogata, M., Sawada, M., Fujino, Y., and Hamaoka, T. (1995) J. Biol. Chem. 270, 2337-2343 8. Watanabe, Y., Shiozuka, K., Ikeda, T., Hoshi, N., Suzuki, T., Hashimoto, S., and Kawashima, H.

(1998) Mol. Brain Res. 58, 83-94

9. International Human Genome Consortium. (2001) Nature 409, 860-921 10. Paul, S., and Lombroso, P. J. (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60, 2465-2482

11. Alonso, A., Sasin, J., Bottini, N., Friedberg, I., Osterman, A., Godzik, A., Hunter, T., Dixon, J. E., and Mustelin, T. (2004) Cell 117, 699-711

12. Blanco-Aparicio, C., Torres, J., and Pulido, R. (1999) J. Cell Biol. 147, 1129-1136

13. Streuli, M., Krueger, N. X., Arineillo, P. M., Tang, M., Munro, J. M., Blattler, W. A., Adler, D. A., Disteche, C. M., and Saito, H. (1992) EMBO J. 11, 897-907

14. Serra-Pages, C., Saito, H., and Streuli, M. (1994) J. Biol. Chem. 269, 23632-23641

15. Gebbink, M. F. B. G., Zondag, G. C. M., Koningstein, G. M., Feiken, E., Wubbolts, R. W., and Moolenaar, W. H. (1995) J. Cell Biol. 131, 251-260

16. Desai, D. M., Sap, J., Schlessinger, J., and Weiss, A. (1993) Cell 73, 541-554

17. Wallace, M. J., Fladd, C., Batt, J., and Rotin, D. (1998) Mol. Cell. Biol. 18, 2608-2616 18. Bilwes, A. M., den Hertog, J., Hunter, T., and Noel, J. (1996) Nature 382, 555-559

19. Meng, K., Rodriguez-Peña, A., Dimitrov, T., Chen, W., Yamin, M., Noda, M., and Deuel, F. (2000)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2603-2608

20. Nam, H. J., Poy, F., Krueger, N. X., Saito, H., and Frederick, C. A. (1999) Cell 97, 449-457 21. Jiang, G., den Hertog, J., Su, J., Noel, J., Sap, J., and Hunter, T. (1999) Nature 401

22. Szedlacsek, S. E., Aricescu, A. R., Fulga, T., Renault, L., and Scheidig, A. J. (2001) J. Mol. Biol. 311, 557-568

23. Kholodenko, B. N. (2002) Trends Cell Biol. 12, 173-177 24. Gonzalez-Gaitan. (2003) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4, 213-224

25. Korolchuk, V., and Banting, G. (2003) Biochem. Soc. 31, 857-860 26. Boehms, M., and Bonifacino, J. S. (2001) Mol. Biol. Cell 12, 2907-2920

28. Dell'Angelica, E. C., Mullins, C., and Bonifacino, J. S. (1999) J. Biol. Chem. 274, 7278-7285 29. Hirst, J., Bright, N. A., Rous, B., and Robinson, M. S. (1999) Mol. Biol. Cell 10, 2787-2802 30. Barois, N., and Bakke, O. (2005) Biochem. J. 385, 503-510

31. Hendriks, W., Schepens, J., Brugman, C., Zeeuwen, P., and Wieringa, B. (1995) Biochem. J. 305, 499- 504

32. Lee, C., and Chen, L. B. (1988) Cell 54, 37-46

33. Mollenhauer, H. H., and Morre, D. J. (1998) Histochem. Cell Biol. 109, 533-543

34. Hirschberg, K., Miller, C. M., Ellenberg, J., Presley, J. F., Siggia, E. D., Phair, R. D., and Lippincott- Schwartz, J. (1998) J. Cell Biol. 143, 1485-1503

35. Martinez-Menarguez, J. A., Geuze, H. J., Slot, J. W., and Klumperman, J. (1999) Cell 98, 81-90 36. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Marra, P., Alberti, S., Buccione, R., Luini, A., and Mironov, A.

A. (2000) J. Cell Biol. 148, 45-58

37. Robertson, A. M., and Allan, V. J. (2000) Mol. Biol. Cell 11, 941-955

38. Roux, A., Capello, G., Cartaud, J., Prost, J., Goud, B., and Bassereau, P. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 99, 5394-5399

39. Sharma, E., and Lombroso, P. J. (1995) J. Biol. Chem. 270, 49-53 40. Marshall, C. J. (1995) Cell 80, 179-185

41. Grewal, S. S., York, R. D., and Stork, P. J. S. (1999) Curr. Opin. Neurobiol. 9, 544-553

42. Kim, W. T., Chang, S., Daniell, L., Cremona, O., Di Paolo, G., and De Camilli, P. (2002) Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 99, 17143-17184

43. Zuñiga, A., Torres, J., Ubeda, J., and Pulido, R. (1999) J. Biol. Chem. 274, 21900-21907 44. Chirivi, R., Dilaver, G., van de Vorstenbosch, R. A., Schepens, J., Croes, H. J. E., Wanschers, J.,

Fransen, J., and Hendriks, W. (2004) Genes Cells 9, 919-933

45. Tanaka, M., Maeda, N., Noda, M., and Marunouchi, T. (2003) J. Neurosci. 23, 2804-2814

46. Wallace, M. J., Batt, J., Fladd, C. A., Henderson, J. T., Skarnes, W., and Rotin, D. (1999) Nat. Genet.

21, 334-338

47. Lonart, G., Schoch, S., Kaeser, P. S., Larkin, S., Südhof, T. C., and Linden, D. J. (2003) Cell 115, 49- 60

48. Petrone, A., Battaglia, F., Wang, C., Dusa, A., Su, J., Zagzag, D., Bianchi, R., Casaccia-Bonnefil, P., Arancio, O., and Sap, J. (2003) EMBO J. 22, 4121-4131

49. Nguyen, T. H., Liu, J. P., and Lombroso, P. J. (2002) J. Biol. Chem. 277, 24274-24279

50. Pelkey, K. A., Askalan, R., S., P., Kalia, L. V., Nguyen, T. H., and Pitcher, G. M. (2002) Neuron 34, 127-138

Abbreviations

aCSF arteficial cerebro-spinal fluid AP adaptor complex

BSA bovine serum albumin

c-AMP cyclic-adenosine monophosphate CLSM confocal laser scanning microscopy COPI/II coat protein complexes

EDTA ethylenediaminetetraacetate EGF epidermal growth factor

EGFP enhanced green fluorescent protein EGFR epidermal growth factor receptor ELISA enzyme-linked immunosorbent assay Endo F endoglycosidase F

Endo H endoglycosidase H

ER endoplasmic reticulum ERK extracellular regulated kinase FACS fluorescence activated cell sorting FCS fetal calf serum

FRET fluorescence resonance energy transfer GFP green fluorescent protein

GGA Golgi-localized, γ-ear containing, ARF-binding protein JNK c-Jun N-terminal kinase

KIM kinase interacting domain KIS kinase specificity domain LTP long-term potentiation

MAPK mitogen-activated protein kinase MEK map kinase kinase

MKK map kinase kinase

mRNA messenger ribonucleic acid MVB multi veiscular bodies

NGF nerve growth factor

NMDA N-methyl-D-aspartate

NSF N-ethylmaleimide-sensitive factor ORF open reading frame

PAGE poly acryl amide gel electroforese PBS phosphate buffered saline

PFA parafolmaldehyde PKA protein kinase A

PTP protein tyrosine phosphatase

PTPBR7 protein tyrosine phosphatase brain clone number 7 PTPPBS protein tyrosine phosphatase PC12/Br7/SL

PTPPBSγ protein tyrosine phosphatase

PTP-SL protein tyrosine phosphatase STEP-like RNA ribonucleic acid

RTK receptor tyrosine kinase

RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction SDS sodium dodecyl sulfate

Sef acronym for similar expression to fgf genes STEP striatal enriched phosphatases

Samenvatting

Voor het optimaal functioneren van levende organismen moeten door de lichaamscellen eiwitten aangemaakt, getransporteerd, gemodificeerd en uiteindelijk weer afgebroken worden. Deze celbiologische processen worden zeer nauwkeurig gereguleerd o.a. door reversibele fosforylering van eiwitten. Eiwitfosforylering (binden van een fosfaatgroep aan een eiwit) gebeurt door enzymen die kinases genoemd worden, terwijl andere enzymen, fosfatases genaamd, de eiwitten kunnen defosforyleren. In de afgelopen decennia is gebleken dat reversibele fosforylering een essentiële rol speelt bij de overdracht van signalen in de cel. Kinases en fosfatases zijn dan ook betrokken bij een veelvoud van levensprocessen, waaronder embryonale ontwikkeling, celbeweging en neuronale celdifferentiatie. Een aantal van de kinases en fosfatases is gelokaliseerd op specifieke organellen in de cel, waaronder transportblaasjes. Dit suggereert dat deze enzymen, naast een rol bij locale communicatieprocessen binnen de cel, ook een rol spelen bij de regulatie van het intracellulaire transport.

Voordat ik mijn promotieonderzoek begon, was er vastgesteld dat de fosfotyrosine fosfatase PTP-SL voorkomt op transportblaasjes in de cel. Het PTP-SL eiwit behoort tot de PTPRR proteïne tyrosine fosfatase subfamilie en wordt in verband gebracht met signaaloverdrachtcascades via zogenaamde MAPKs (mitogen-activated protein kinases). In dit proefschrift worden studies beschreven waarin de moleculaire diversiteit van verschillende PTPRR familieleden onderzocht is, in het bijzonder voor wat betreft de isovorm-specifieke lokalisatie en de mogelijke betrokkenheid bij intracellulair transport.

In hoofdstuk 2 wordt de verkenning van de (moleculaire) omgeving van een tweetal PTPRR-isovormen, te weten PTPBR7 en PTP-SL, beschreven. Bestudering van de subcellulaire localisatie van deze fosfatases in zenuwcellen liet zien dat PTPBR7 en PTP-SL in het Golgi-apparaat en in late endosomale structuren gevonden worden. Daarnaast bevindt het PTPBR7-eiwit zich ook op het celmembraan. De intracellulaire lokalisaties van PTPBR7 en PTP-SL vertonen grote gelijkenis met die van het β4-adaptin eiwit, een subunit van het AP-4 adaptor complex. De heterotetramere adaptor complexen, AP-1 t/m AP-4, zijn betrokken bij het sorteren van eiwitten die door transportblaasjes vervoerd worden. Het tegelijkertijd tot expressie brengen van PTP-SL en β4-adaptin in zenuwcellen bleek een

rond het Golgi-apparaat en transportblaasjes wordt PTP-SL dan vrij gevonden in het cytoplasma. De lokalisatie van β4-adaptine bleek overigens niet veranderd. Hoewel in het ‘yeast 2-hybrid systeem’ zelfs aanwijzingen voor een directe interactie tussen PTP-SL en β4- adaptine werden verkregen, kon een complex van deze twee eiwitten in neuronale cellen niet worden aangetoond. De genoemde resultaten wijzen echter wel op een mogelijk regulerende rol van PTPRR fosfatases in het blaasjestransport in cellen.

Uit de literatuur en sequentie-databanken valt af te leiden dat er mogelijk meerdere eiwitten (isovormen) gecodeerd werden door het muizengen Ptprr. In hoofdstuk 3 hebben we een gedetailleerde analyse uitgevoerd waarbij zo volledig mogelijk de transcripten en eiwitproducten horende bij het gen Ptprr zijn bepaald. Uit deze experimenten is gebleken dat het gen Ptprr aanleiding geeft tot vier verschillende eiwit-isovormen (PTPBR7, PTP-SL, PTPPBSγ-42 en PTPPBSγ-37) door het gebruik van verschillende promoters, alternatieve splicing en meerdere translatie-initiatie sites. De vier isovormen verschillen in hun N- terminale gedeelte, wat resulteert in PTPRR subtypes die ook op (sub)cellulair niveau verschillen: PTPBR7 is een receptorachtig transmembraan eiwit, PTP-SL blijkt membraangeassocieerd, en de twee PTPPBSγ isovormen zijn cytosolische eiwitten.

Hoofdstuk 4 handelt over de posttranslationele modificaties die de PTPRR eiwit- isovormen kunnen ondergaan. Alle isovormen blijken op een tweetal plekken gefosforyleerd te kunnen worden. Daarnaast is gebleken dat alle PTPRR isovormen een relatief korte levensduur, van enkele uren, hebben. Ook werd aangetoond dat PTPBR7 proteolytisch gekliefd kan worden op een furine-achtige convertase consensus site in het N-terminale gedeelte. De klieving gebeurt vooral extracellulair en neemt toe in aanwezigheid van serum in het medium. Hiermee wordt dus een vijfde PTPRR isovorm gecreëerd: PTPBR7-65.

Een gedetailleerde analyse van de subcellulaire localisatie van PTPBR7 en PTP-SL, door middel van lichtmicroscopische (immunofluorescentie) en electronenmicroscopische studies (ultrastructureel), staat beschreven in hoofdstuk 5. Aangetoond wordt dat PTPBR7 en PTP-SL tegelijkertijd aanwezig kunnen zijn in dezelfde ‘late’ endosomen. Belangwekkend is ook dat de aanwezigheid van PTPBR7 op ‘vroege’ endosomen kon worden aangetoond met behulp van electronenmicroscopie. Deze resultaten zouden stroken met een model waarbij PTPBR7 en PTP-SL bij verschillende stadia van de endocytotische route betrokken zijn. Met behulp van microscopische studies aan levende cellen (live imaging) hebben we verder de

PTPBR7 als PTP-SL blaasjes vertonen een grote mate van mobiliteit, en transport van blaasjes van en naar het Golgi-apparaat kon worden waargenomen. Ook in andere delen van de cel is tweerichtingsverkeer van blaasjes waargenomen. De aanwezigheid van PTPBR7 en PTP-SL in zeer bewegelijke blaasjes in specifieke delen van de endocytotische route impliceert een dynamische rol voor deze fosfatases in intracellulair transport.

Hoofdstuk 6 tenslotte, bevat een afrondende bespreking van de resultaten uit het in de voorafgaande hoofdstukken beschreven onderzoek en er worden enkele suggesties gedaan voor vervolgstudies. Vooral wordt hierbij gewezen op de nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de fosforylering van signaaloverdrachteiwitten in levende cellen met geavanceerde microscopische beeldvormingtechnieken.

Samengevat kan gesteld worden dat één enkel gen, Ptprr, in staat is om via verschillende mechanismen een groot repertoire aan functioneel verwante eiwitten te genereren. Doordat deze eiwitten naar specifieke plaatsen in de cel gedirigeerd worden, ontstaat een veelvoud aan mogelijkheden voor locale en ‘tijdelijke’ communicatie op het raakvlak van signaaltransductie en eiwittransport.