4.3 Using the Log Files for Troubleshooting
4.3.3 Sample Authentication Traces
3.1.1. Células
En el presente trabajo se han utilizado las siguientes células: ‐ DF‐1: Fibroblastos inmortalizados de pollo (ATCC® CRL‐12203™). ‐ CEF: Cultivos primarios de fibroblastos embrionarios de pollo (Gallus gallus) obtenidos a partir de embriones tras 11 días de incubación (MSD, Salamanca). ‐ HEK‐293T: Células embrionarias humanas de riñón inmortalizadas (ATCC® CRL‐3216™). ‐ HEK‐293F: Células embrionarias humanas de riñón inmortalizadas derivadas de HEK‐293T; crecimiento en suspensión (Gibco).‐ THP‐1: Células monocíticas humanas procedentes de un paciente con leucemia monocítica (ATCC® TIB‐202™).
‐ moDCs: Células dendríticas humanas derivadas de monocitos obtenidas a partir de sangre de donantes sanos.
‐ esplenocitos de ratón: Células primarias obtenidas a partir de los bazos de ratones inmunizados.
3.1.2. Medios de cultivo
Para las células DF‐1, CEF y HEK‐293T se utilizó el medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco) complementado con aminoácidos no esenciales (1X, Sigma) y L‐Glutamina (2 mM, Merck) y con 10% de suero fetal de ternera (FCS) (Gibco).
Para THP‐1, moDCs y los esplenocitos de ratón se utilizó el medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI‐1640) (Gibco) complementado con HEPES pH 7.4 (10 mM, Merck), β‐ mercaptoetanol (10 µM, Sigma), L‐glutamina (2 mM, Merck) y 10% FCS.
Para las células HEK‐293F se usó el medio de expresión FreeStyle™ (Life Technologies). El medio Opti‐MEM (Gibco) se utilizó como medio de cultivo transitorio durante las transfecciones con plásmidos.
El medio de infección consistió en DMEM‐2% FCS y se añadió tras el periodo inicial de adsorción del virus durante 1 hora en DMEM sin suero y posterior retirada del mismo. El medio de infección sólido se utilizó para seleccionar las placas de los virus recombinantes y consistió en una proporción 1:1 de DMEM 2X‐4% FCS y agarosa 1.9% (Conda) previamente fundida.
3.1.3. Bacterias
Las cepas bacterianas utilizadas para las transformaciones y crecimiento de los plásmidos fueron electrocompetentes DH10B de Escherichia coli (New England Biolabs) y quimiocompetentes DH5α de Escherichia coli (CNB). Las bacterias se cultivaron en medio Luria‐ Bertani (LB) (CNB) [209] o Terrific Broth (TB) (VWR) en presencia de ampicilina (100 µg/ml, Merck) o kanamicina (100 µg/ml, Merck).
3.1.4. Virus
Todos los VACV recombinantes utilizados en este trabajo derivan del virus vaccinia modificado de Ankara o modified vaccinia virus Ankara (MVA) cedido por el Dr. Gerd Sutter del Instituto de Virología Molecular de Múnich (Alemania). Los diferentes antígenos heterólogos fueron insertados en el locus TK viral (gen J2R) y se encuentran bajo el control del promotor viral sintético temprano/tardío (pE/L). En la Tabla 2 se muestran los distintos virus MVA generados en este estudio. Además de estos virus MVA, también se utilizó el virus Sendai, cepa Cantell, cedido por la Dra. Dolores Rodríguez (CNB).
Virus Antígeno insertado Gen
delecionado Referencia MVA‐WT ‐ ‐ [176] MVA‐PS‐GFP Proteína verde fluorescente (GFP) (Aquorea victoria) J2R [210] MVA‐HCV Genes del HCV, genotipo 1a, cepa H77 J2R [183] MVA‐HCV ΔC6L Genes del HCV, genotipo 1a, cepa H77 J2R, C6L [211] MVA‐HCVmut Genes del HCV, genotipo 1a, cepa H77 con NS3 mutada (S139A) y péptidos 2A entre NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b J2R ‐ Tabla 2. VACV recombinantes utilizados en este estudio.
3.1.5. Plásmidos
‐ Plásmidos de transferencia empleados para generar los virus MVA recombinantesLa estrategia seguida para generar los diferentes virus MVA recombinantes se basa en procesos de recombinación homóloga que ocurren dentro de la célula entre un plásmido de transferencia y el genoma viral. Para que ocurra este proceso, los plásmidos de transferencia deben contener diferentes elementos dependiendo de si van a dirigir la inserción de antígenos o la deleción de genes en el MVA.
Regiones flanqueantes a la zona de inserción deseada: Son secuencias que incluyen las regiones izquierda (L) y derecha (R) del gen TK de MVA y que se va a sustituir por nuestro antígeno de interés y las cuales conducirán los fenómenos de recombinación dentro de la célula.
Antígenos de interés: Se encuentran entre las regiones flanqueantes L y R. De esta manera, como consecuencia de la recombinación, los antígenos de interés junto a un gen marcador de selección se insertarán en el genoma viral.
Gen marcador de selección en cultivo celular: Se encuentra adyacente a los antígenos de interés, dentro de las regiones flanqueantes. Entre los antígenos de interés y el gen marcador se encuentra repetida otra zona de recombinación (región flanqueante L) que dará lugar a la posterior eliminación del gen marcador, produciéndose así virus recombinantes que contienen únicamente el antígeno de interés. En este trabajo se utilizó el gen marcador LacZ (β‐galactosidasa) para seleccionar en cultivo celular los virus recombinantes intermediarios que forman placas de lisis azules.
Gen de selección en cultivo bacteriano: Para clonar y crecer los plásmidos, éstos contienen el gen de resistencia a ampicilina (β‐Lactamasa) para seleccionar las bacterias transformadas con el mismo.
A continuación, se muestra un esquema de los diferentes elementos contenidos en estos plásmidos: Figura 7. Esquema representativo de los plásmidos de transferencia pCyA‐HCV y pCyA‐HCVmut.
Dentro de los antígenos del HCV clonados se incluyeron los genes del HCV desde Core hasta NS5b. L: izquierda; R: derecha.
Los plásmidos utilizados en este trabajo para generar virus MVA recombinantes fueron: ‐ pCyA‐HCV: Vector empleado para generar el virus MVA‐HCV. Los antígenos de interés son el genoma casi completo del HCV (Core, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b;
Región flanqueante L Región flanqueante L LacZ Genes del HCV Región flanqueante R
pCyA‐HCV
o
pCyA‐HCVmut
Ampicilinagenotipo 1a, cepa H77), exceptuando la parte C‐terminal de la proteína NS5b y las regiones no codificantes de los extremos. Las regiones flanqueantes son los extremos del locus TK del MVA, donde se dirigirá la inserción. Este plásmido fue generado y descrito previamente [183].