esfingolípidos. Obtenido de “Ceramide in the eukaryotic stress response”. Hannun YA y Luberto C.
Trends in Cell Biol (2000) 10:73-79.
La utilización de Cer exógenas constituye una importante herramienta para el estudio del tráfico intracelular y el metabolismo de estos lípidos, así como también para evaluar los efectos que ejercen las Cer sobre diversos aspectos de la biología celular. Las Cer de corta cadena son rápidamente incorporadas por las células y se acumulan en el aparato de Golgi (Lipsky y Pagano, 1983; Pagano y col., 1991). Incluso
los análogos fluorescentes de Cer, como C6-NBD-Cer y C5-BODIPY-Cer son
ampliamente utilizados como sondas específicas de esta organela (Lipsky y Pagano, 1983; Pagano y col., 1991). Las Cer de cadena corta tienen la capacidad de experimentar movimientos rápidos y espontáneos entre diferentes membranas (movimientos intermembrana), así como también de una a otra hemicapa dentro de la misma membrana (movimientos transmembrana o “flip-flop”) (Koval y Pagano, 1990; Venkataraman y Futerman, 2000). La internalización de SLs en células de mamífero fue también estudiada por Zegers y col. (1997) utilizando los análogos fotoactivables
125I-N
3-Cer y 125I-N3-glucocilceramida (125I-N3-GlcCer). Estos autores observaron que la
Cer fotoactivable era capaz de internalizarse eficientemente tanto a 37°C como a 4°C, indicativo de una transferencia por difusión monomérica, a diferencia del análogo de GlcCer, el cual solo se internalizó a 37°C, reflejando un mecanismo endocítico de internalización. Por su carácter altamente hidrofóbico, durante mucho tiempo se dudó de la capacidad de las Cer de larga cadena de realizar movimientos transmembrana (“flip-flop”) (Venkataraman y Futerman, 2000; van Blitterswijk y col., 2003). Sin embargo, recientemente se pudo comprobar la rápida translocación de estas especies lipídicas tanto en vesículas gigantes (Lopez-Montero y col., 2005) como en la membrana plasmática de células en cultivo (Mitsutake y Igarashi, 2007).
ceramida colesterol fosfolípido A) Movimiento intermembrana B) Movimiento transmembrana (“flip-flop”) C) Difusión lateral y formación de dominios ceramida colesterol fosfolípido A) Movimiento intermembrana B) Movimiento transmembrana (“flip-flop”) C) Difusión lateral y formación de dominios C2-Cer C6-Cer C18-Cer C2-Cer C6-Cer C18-Cer II) I)
Figura 29. I) Estructuras químicas correspondientes a Cer de corta y larga cadena. La base
esfingoide se muestra en azul y el ácido graso en rojo. II) Propiedades biofísicas de las Cer. Obtenido de “Ceramide as a second messenger: sticky solutions to sticky problems”.
Venkataraman K y Futerman AH Trends Cell Biol (2000) 10:408-412.
Las Cer pueden ser hidrolizadas por acción de enzimas denominadas ceramidasas (Birbes y col., 2002; el Bawab y col., 2002) dando como producto esfingosina (Sph). La Sph a su vez puede convertirse en esfingosina 1-fosfato (Sph-1- P) (Tani y col., 2005) (Esquema 5). Al igual que las Cer, sus metabolitos, Sph y Sph-1- P constituyen también lípidos bioactivos muy importantes, los cuales están implicados en una gran variedad de procesos biológicos (ver revisiones en Posse de Chaves, 2006; Hla, 2003; Cuvillier, 2002). Dado que la Cer puede ser rápidamente convertida en Sph y Sph-1-P (Taha y col., 2006), es importante diferenciar si es específicamente la Cer o sus metabolitos los que inducen efectos celulares. En muchos casos las respuestas celulares a Cer y sus metabolitos son diferentes e incluso opuestos, siendo Cer la que usualmente inhibe la proliferación y promueve la apoptosis, y la Sph-1-P quien estimula el crecimiento y suprime la apoptosis (ver revisiones en Maceyka y col., 2002; Posse de Chaves, 2006). Sin embargo, en bajas concentraciones, las Cer pueden tener efectos beneficiosos sobre las células. Así por ejemplo, la Cer y no la Sph o Sph-1-P, protege a las motoneuronas de la apoptosis (Irie y Hirabayashi, 1999).
En neuronas de hipocampo son las Cer exógenas y no la Sph o Sph-1-P las que promueven la supervivencia, aunque los tres lípidos pueden desencadenar la muerte
celular a concentraciones superiores a 5 "M (Mitoma y col., 1998).
Además de sus efectos como segundos mensajeros, las Cer promueven cambios en las propiedades biofísicas de las membranas. Como ya se dijo en los capítulos anteriores, los SLs y el colesterol coexisten en microdominios de membrana denominadas balsas lipídicas (Simons e Ikonen, 1997). La generación de Cer dentro de dichas balsas por hidrólisis de la SM cambia dramáticamente las propiedades biofísicas de los mismos ya que las moléculas de Cer espontáneamente se asocian unas con otras y tienen tendencia a formar pequeños microdominios de membrana enriquecidos en Cer (Holopainen y col., 1998; Kolesnick y col., 2000). Estos microdominios, a su vez, son capaces de fusionarse en grandes macrodominios o plataformas (Nurminen y col., 2002; Holopainen y col., 1998; Kolesnick y col., 2000). Las Cer estabilizan las balsas lipídicas (Xu y col., 2001) ya que permiten un alto grado de empaquetamiento de los lípidos (Kolesnick y col., 2000). Además, la Cer puede alterar la composición de estos microdominios mediante competencia y exclusión del colesterol de los dominios ordenados en las bicapas lipídicas (Bjorkqvist y col., 2005; London y London, 2004; Ali y col., 2006). La función de estas plataformas enriquecidas en Cer es, en general, concentrar y reorganizar receptores y moléculas señalizadoras en regiones particulares de la membrana plasmática (Simons y Toomre, 2000; Edidin, 2003), facilitando y amplificando el proceso de señalización celular. La transformación de pequeñas balsas (“inactivas”) en grandes plataformas de señalización (“activas”) por generación de Cer explica la función de este lípido en los procesos de activación celular mediados por receptores, estímulos de estrés, etc. (ver revisión en Bollinger y col., 2005).
En el Capítulo 2 se discutió la importancia del colesterol en la regulación de los niveles de AChR en la superficie de células CHO-K1/A5. Con respecto a los SLs,
Roccamo y col. (1999) demostraron que en células CHO-SPB1/SPH (una línea celular deficiente en SLs que expresa el AChR), la biosíntesis reducida de estos lípidos provoca la disminución de los niveles de receptores en la superficie celular. En este sentido, Baier y Barrantes (2007) remarcaron la relación existente entre los niveles de SLs y el tráfico exocítico del AChR, y propusieron la participación de estos lípidos en el proceso de ensamblado del receptor. La importancia de los SLs en la regulación del tráfico proteico está bien documentada. Las proteínas recientemente sintetizadas cuyo destino final es la superficie celular, deben viajar a través de compartimientos conteniendo cuali- y cuantitativamente diferentes SLs, y las alteraciones en los niveles de SLs pueden influir sobre el transporte proteico (Rosenwald y col., 1992). En levaduras, la síntesis alterada de SLs causa defectos en el tráfico de la proteína residente en microdominios de membrana, Fus-Mid-GFP desde el TGN a la membrana plasmática (Proszinski y col., 2005). La inhibición de la síntesis de GlcCer por tratamiento con la droga PDMP (inhibidor de la enzima GlcCer sintasa) resulta en la disminución de la llegada a superficie de la proteína MDR1 en hepatocitos, demostrando la importancia de este SL para el correcto tráfico de esta proteína desde el Golgi a la superficie apical (Wojtal y col., 2006). Más recientemente Lucic y col. (2007) observaron que la inhibición de la síntesis de SM reduce la secreción de la proteína apoE por macrófagos y aumenta la retención intracelular de esta proteína.
En este capítulo estudiamos los efectos ejercidos por las Cer, precursoras en la síntesis de SLs, sobre el tráfico y diferentes propiedades del AChR. El modelo experimental elegido consistió en utilizar la línea celular CHO-K1/A5, que expresa al AChR de tipo muscular adulto. Las células se incubaron con diferentes
concentraciones de Cer de cadena corta (C6-Cer), de cadena larga (Cer provenientes
de cerebro bovino), o bien se expusieron a la incubación con SMasa en el medio de cultivo para evaluar los efectos resultantes de la generación de Cer endógenas.
Materiales y métodos Materiales
Las C6-ceramidas (C6-Cer) se obtuvieron en Matreya (Pleasant Gap,
Pennsylvania, EEUU). Las ceramidas cerebrales (Cer-cereb) de cerebro bovino, la
esfingosina (Sph), esfingomielinasa (SMasa) de Bacillus cereus, el ácido okadaico (Ác.
Ok), el pseudosustrato de la proteína kinasa C !# (PKC!) y la albúmina bovina (fracción
V, para cultivo celular), se obtuvieron de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO,
EEUU). Alexa647
$BTX, NBD-C6-Cer y BODIPY-C5-SM fueron obtenidos de Molecular
Probes (Invitrogen Corp., CA, EEUU). La mutante no tóxica de la lisenina conjugada con la proteína fluorescente roja (nt-lysenin-RFP) fue cedida por el Dr. Toshihide Kobayashi, RIKEN (Institute of Physical and Chemical Research), en Japón. El resto de los reactivos empleados en el presente capítulo ya fue descripto en la sección:”Materiales y Métodos” correspondiente al capítulo 2.
Cultivo celular
Las células CHO-K1/A5 crecieron en medio Ham’s F-12 suplementado con
glutamina, 40 "g/ml de sulfato de gentamicina y 10% de suero fetal bovino, en un
incubador Napco mantenido a 37%C, con una mezcla de 5% CO2/ 95% aire. Luego de
2-3 días de crecimiento bajo estas condiciones, las células se lavaron e incubaron en medio Ham’s F-12 sin suero conteniendo albúmina (probada para cultivo celular,
Sigma, MO, EEUU) (control) o C6-Cer, Cer-cereb o Sph, por un período adicional de 1,
3 ó 5 hs. Las células se incubaron a diferentes concentraciones del lípido (12.5, 25 ó
37.5 "M). Tanto las C6-Cer como las Cer-cereb se agregaron al medio de cultivo en
forma de complejos con albúmina, según lo descripto por Rosenwald y Pagano (1993), mientras que la Sph se solubilizó en metanol (concentración final del solvente en el medio de cultivo: 0.2%).
Los tratamientos por períodos más prolongados se realizaron incubando las
células con 5 "M de C6-Cer o Cer-cereb por 24 h en medio Nutridoma-BO sin suero.
Por otra parte, se realizaron otros experimentos en los cuales las células fueron incubadas en medio sin suero en ausencia (control) o presencia de 100 mU/ml de
SMasa, durante 1h, a 37%C. En algunos casos también se realizó la preincubación de
las células con 0.1 "M de ácido okadaico (solución madre, 10 "M en agua) previo al
tratamiento con SMasa.
Para el tratamiento con el antibiótico nistatina, la droga (50 "g/ml) se agregó en
medio Ham´s F12 sin suero, y las células se incubaron a 37%C por 30 min, seguidos de
1 h de incubación adicional con SMasa, en presencia de nistatina.
Las incubaciones con SM exógena se realizaron a una concentración final de
10 "M, como lo describieron Baier y Barrantes (2007). En este caso se utilizó
etanol:decano (98:2) como vehículo, el cual se mantuvo por debajo del 0.16% en el medio de cultivo.
Actividad de la enzima lactato deshidrogenasa
Se determinó la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) (Yildiz y col., 1998; Fujii y col., 1998) en el medio de cultivo de células CHO-K1/A5 controles y
tratadas con C6-Cer como índice de daño celular. Como control positivo, se evaluó la
actividad de la enzima en muestras sometidas a disrupción en un sonicador durante 5 seg. La actividad de LDH se monitoreó en las distintas condiciones por medio de un ensayo cinético de detección al UV (Laboratorios Wiener, Rosario, Argentina) en el cual se mide la disminución de la absorbancia correspondiente a la transformación de NADH en NAD. La lectura se efectuó en un espectrofotómetro a 340 nm. Los datos de absorbancia obtenidos a diferentes intervalos de tiempo son proporcionales a la
cantidad de NADH convertido en NAD+ a medida que la reacción se va produciendo.
Cromatografía en capa fina utilizando lípidos fluorescentes
En algunos experimentos las C6-Cer se agregaron al medio de cultivo como
precursor de la síntesis de SLs complejos. Con este fin, las células CHO-K1/A5 crecieron en cápsulas de 10 cm en medio completo Ham´s F-12 durante 24 hs. Las células se lavaron posteriormente con PBS estéril y el medio completo se reemplazó
por medio de Nutridoma-BO sin suero. Una mezcla de C6-Cer (concentración final 5
"M) y de NBD-C6-Cer (trazas; concentración final 25 nM) se agregó al medio de cultivo
y se incubaron las células a 37°C por 30 min (T0.5) o 24 h adicionales (T24). Las células
se lavaron con PBS y se utilizaron para la extracción lipídica como fue descripto anteriormente. Los distintos esfingolípidos se separaron por cromatografía en capa
fina (CCF) usando placas de sílica gel G y CHCl3:CH3OH:H2O (65:25:4) (vol/vol) como
fase móvil (Lipsky y Pagano, 1983; Loidl y col., 2002). En la cromatografía se usaron
estándares fluorescentes de NBD-C6-Cer y BODIPY-C5-SM. Las manchas
correspondientes a los lípidos covalentemente derivatizados con fluoróforos se detectaron mediante iluminación con luz UV.
Transfección transiente
Las células CHO-K1/A5 se transfectaron en forma transiente con los ADNc que codifican para las proteínas de fusión fluorescentes pEYFP-GalT o la glicoproteína del virus de estomatitis vesicular (VSVG) acoplado a proteína fluorescente verde (GFP),
utilizando el reactivo de transfección Polifect transfection reagent (Quiagen) siguiendo
el protocolo correspondiente. La transfección se realizó 24 h antes del tratamiento con
Cer.
Microscopía de fluorescencia a) Obtención de imágenes
Las imágenes de microscopía de epifluorescencia se obtuvieron con un microscopio Nikon Eclipse E-600 acoplado a una cámara CCD, SBIG modelo ST-7. Las imágenes de microscopía confocal fueron tomadas con un microscopio Leica TCS SP2 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH).
b) Marcación del AChR de superficie e intracelular
El AChR de superficie se marcó con Alexa488$BTX, mientras que para el
marcado del receptor intracelular se utilizó Alexa594
$BTX, tal como se explicara en el
capítulo anterior.
c) Marcado de la SM de la membrana plasmática con lisenina
Se utilizó la sonda lisenina, la cual detecta y se une específicamente a la SM (Nakai y col, 2000) como herramienta para evaluar la acción de la enzima SMasa sobre la SM de la superficie celular. Utilizamos una mutante no tóxica de la lisenina, conjugada con la proteína fluorescente roja (nt-lisenina-RFP; Kiyokawa y col., 2005). Luego de 1 h de incubación en presencia o ausencia de SMasa, las células se lavaron e incubaron con lisenina (1/50 en PBS) durante 1 h en hielo, y se cuantificó la intensidad de fluorescencia correspondiente a lisenina por microscopía de fluorescencia, tanto en células controles como en las tratadas con SMasa.
d) Generación de C5-BODIPY-Cer a partir de C5-BODIPY-SM
La generación endógena de Cer por acción de la SMasa agregada al medio de cultivo, se observó mediante microscopía de fluorescencia. Primero, las células se
incubaron con 15 nM C5-BODIPY-SM en medio Ham’s F-12 sin suero durante 30 min a
4%C para marcar la mebrana plasmática de las células CHO-K1/A5. Luego de lavarlas
con PBS para remover la C5-BODIPY-SM no unida, las células se incubaron durante 5
min a 37%C en ausencia o presencia de SMasa (Zha y col., 1998).
Obtención de láminas de membrana plasmática y tratamiento con SMasa
Para la preparación de las láminas de membrana plasmática, las células CHO- K1/A5 se crecieron en cubreobjetos recubiertos con polilisina y se disrrumpieron como lo describen Borroni y col. (2007) y Kellner y col. (2007). Para ello se utilizó un pulso de ultrasonido de 300 ms en buffer KGlu (20 mM Hepes, pH 7.2, conteniendo 120 mM de glutamato de potasio, y 20 mM de acetato de potasio) frío. Para promover la hidrólisis de la SM, las láminas de membrana celular se incubaron por 30 min a 37°C en buffer KGlu conteniendo 100 mU/ml SMasa, y posteriormente se lavaron con buffer KGlu frío. Las láminas de membrana controles se incubaron solamente con buffer
KGlu. Se realizó la doble marcación de las láminas con Alexa488
$BTX y nt-lisenina-
RFP durante 60 min a 4°C en buffer KGlu, y se lavaron 2-3 veces con buffer KGlu. Luego se fijaron con 4% PFA en PBS durante 30 min, y se lavaron con PBS.
Finalmente, la láminas de membrana se marcaron con 25 "l/ml de una solución
saturada de TMA-DPH en PBS, para poder identificar las láminas de membrana por microscopía de fluorescencia, pero evitando la selección preferencial de aquellas que
presentaran mayor intensidad en los canales correspondientes a Alexa488$BTX o nt-
lisenina-RFP.
Estudios de internalización del AChR
Los AChR de superficie se marcaron con Alexa488$BTX a 4%C como se
describió anteriormente, seguido de la incubación a 37%C por períodos crecientes de
tiempo (de 0 a 4 h) en ausencia (control) o presencia de SMasa. La intensidad de fluorescencia en la superficie celular y la relación [AChR de superficie/AChR total] se calculó para cada tiempo de incubación. En otro caso se recurrió al empleo de un
protocolo de marcado doble como lo describen Borroni y col. (2007): las células se
marcaron en primer lugar con Alexa647
$BTX (infrarrojo) a 4°C y luego se incubaron a
37°C por 0 y 1 h, respectivamente para favorecer la endocitosis del AChR. Los AChRs remanentes en la superficie celular se marcaron posteriormente con el anticuerpo mAb
210 (el cual reconoce un epitope extracelular de la subunidad $ del AChR) a 4°C, y se
marcaron subsecuentemente con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa488
(verde).
Evaluación del número de AChR desensamblados
La determinación de los AChR desensamblados se realizó según Baier y col.
(2006). El fundamento del método radica en lo siguiente la $BTX se une tanto a
receptores ensamblados como a las subunidades $ desensambladas; la
carbamilcolina, en cambio, se une sólo a las subunidades $ ensambladas. Por lo tanto,
en presencia de carbamilcolina, la $BTX fluorescente sólo podrá unirse a las
subunidades $ no ensambladas constituyendo el valor de intensidad de fluorescencia
de Alexa594$BTX un índice del número de receptores desensamblados. Las células se
sometieron al protocolo habitual de marcación del AChR intracelular (ya descripto) con
la diferencia que, con anterioridad a la adición de Alexa594
$BTX, éstas se incubaron
con 10 mM de carbamilcolina en PBS durante 1 h, a temperatura ambiente. La
incubación con la $BTX fluorescente se realizó en presencia de carbamilcolina. Se
midió la intensidad de fluorescencia y se calculó el porcentaje de AChRs desensamblados por comparación con la señal fluorescente en ausencia de carbamilcolina (receptores intracelulares totales = AChR ensamblado + AChR desensamblado).
Resultados
1. Incubación de células CHO-K1/A5 con bajas concentraciones de Cer 1.1. Distribución del AChR evaluada por microscopía de fluorescencia
Con el fin de evaluar si las Cer agregadas en forma exógena afectan la distribución del AChR, las células CHO-K1/A5 fueron incubadas durante 24 h en medio
Nutridoma-BO sin suero en presencia de 5 "M C6-Cer. Se marcó el AChR de
superficie con Alexa488$BTX y el receptor intracelular con Alexa594$BTX. Luego del
tratamiento con C6-Cer pudimos observar que la señal de superficie correspondiente a
AChRs marcados con Alexa488$BTX aumentó en un 50% (Fig. 30A y B), mientras que
la fluorescencia intracelular disminuyó aproximadamente un 30% (Fig. 31A). El patrón de fluorescencia correspondiente a AChR intracelular no evidenció cambios luego del tratamiento con Cer (Fig. 31B), así como tampoco se vio afectada la morfología del TGN, evaluada por marcación con el anticuerpo marcador específico de dicha organela, anti-sintaxina 6 (Fig. 31B).
Aunque las Cer de cadena corta (C2-Cer) existen en la naturaleza (Sot y col.,
2005), en algunos casos los efectos ejercidos por éstas pueden diferir de aquéllos inducidos por las especies de cadena larga (ver revisión en van Blitterswijk, 2003). Por
este motivo, decidimos comparar los resultados obtenidos con las C6-Cer con los
efectos producidos por las Cer de larga cadena, a las que llamamos Cer cerebrales (Cer-cereb). Para ello, utilizamos una mezcla compleja de Cer de larga cadena, de cerebro bovino, incubándose las células bajo las mismas condiciones que las utilizadas con las Cer de corta cadena. De igual modo, se marcó el AChR de superficie
con Alexa488$BTX y se las observó mediante microscopía de epifluorescencia. Como
se puede observar en la Fig. 30A y B, las Cer-cereb fueron también capaces de incrementar (42% de aumento) el AChR de superficie.
C -Cer
6Cer-nat
Alexa
488BTX
$
A
B
0 30 60 90 120 150 180control C6-Cer Cer-cereb
* ** In te ns id ad de F lu or es ce nc ia (% )
control
Figura 30. Microscopía de fluorescencia del AChR de superficie en células
CHO-K1/A5 tratadas con bajas concentraciones de Cer. A) Imágenes de
microscopía de fluorescencia de AChRs de superficie marcados con Alexa488$BTX
en células CHO-K1/A5 crecidas durante 24 h bajo condiciones controles (panel de la izquierda), o incubadas con 5 "M C6-Cer (panel medio) o 5 "M Cer-cereb (panel de la derecha) en medio Nutridoma-BO. B) Porcentaje de intensidad de fluorescencia correspondiente a receptores de superficie marcados con
Alexa488$BTX en células CHO-K1/A5 incubadas bajo las condiciones
experimentales descriptas en (A). ** p< 0.01 y * p< 0.05. Escala: 10 "m.
Figura 31. Distribución del AChR intracelular en células tratadas con 5 "M C6-
Cer. A) Cuantificación de la señal de fluorescencia correspondiente a AChRs intracelulares marcados con Alexa594
$BTX en células CHO-K1/A5 tratadas con 5 "M C6-Cer durante 24 h en medio Nutridoma-BO. *p<0.05. B) Imágenes de microscopía de fluorescencia confocal mostrando la colocalización de los
receptores intracelulares marcados con Alexa647
$BTX (panel de la izquierda) con el
marcador de TGN sintaxina 6 (panel medio) en células controles y en las tratadas con 5 "M C6-Cer. En el panel de la derecha se observa la superposición de ambas marcas fluorescentes. Escala: 10 "m.
1.2. Evaluación de la afinidad del AChR por $BTX
Posteriormente se realizaron experimentos con [125I] $BTX para determinar si el
tratamiento con bajas concentraciones de Cer afectaban la afinidad del AChR por este
antagonista competitivo. El Bmáx correspondiente a receptores de superficie obtenido a
partir de las transformadas de Scatchard fue un 40% superior en las células tratadas
con C6-Cer (Fig. 32) en coincidencia con los resultados obtenidos en los experimentos