Scalability Evaluation

LOURDES PRIETO SOLLA

Laboratorio de Biología-ADN de la Comisaría General de Policía Científica

La necesidad de estudiar ADN no humano con fines forenses se hace cada día más patente y actualmente es frecuente que se solicite a los laboratorios el análisis de muestras de origen no humano. Existen multitud de situaciones en las que cabe este tipo de análisis: restos de origen no humano en la escena del crimen (pelos de animales domésticos, restos vegetales, etc), tráfico ilegal de especies protegidas o en peligro de extinción, identificación de fauna cadavérica con el fin de estimar la data la muerte (identificación de larvas de insectos), fraude en la composición de alimentos procesados, investigación de accidentes de tráfico causados presuntamente por animales, negligencia médica en casos de infecciones (transmisión de VIH o hepatitis C), bioterrorismo (ántrax), etc.

El análisis de restos biológicos no humanos con interés forense se ha abordado tradicionalmente mediante estudios inmunológicos o análisis de proteínas. Estos métodos encuentran su limitación cuando las muestras a estudiar no se encuentran en condiciones idóneas de conservación. Con el desarrollo de la biología molecular han surgido nuevos métodos basados en las diferencias genéticas entre especies. El análisis de ADN mitocondrial (ADNmt) es el más apropiado para estudiar restos no humanos fundamentalmente por dos motivos: (i) la gran cantidad de copias por célula permite que muestras críticas, que no dan resultados con el estudio de ADN nuclear, puedan ser analizadas (pelos, alimentos tratados) y (ii) su tasa de mutación es más rápida que la del ADN nuclear, hecho que permite encontrar diferencias en las secuencias de especies muy cercanas.

Las regiones de ADNmt más utilizadas en genética forense con fines de identificación de especie son el gen responsable del citocromo b (cytb) y los ADNs ribosómicos 12S y 16S. Los análisis se realizan mediante PCR y posterior secuenciación del producto amplificado. Para ello, dentro de estas tres regiones se han buscado dos tipos de zonas nucleotídicas: (i) zonas muy

conservadas (con poca variabilidad entre especies) con el fin de poder diseñar

primers universales que permitan la amplificación de ADN de los principales

grupos taxonómicos y (ii) zonas menos conservadas que permitan la discriminación entre las muestras estudiadas al menos a nivel de género. Así, con un único par de primers se puede amplificar cada región en distintas especies y la secuencia obtenida tras la amplificación puede comparase con secuencias conocidas de diferentes especies.

El uso de esta técnica implica el conocimiento de la filogenia de las especies involucradas, el manejo de las bases de datos de secuencias de ADN disponibles en la red (GenBank, EMBL), así como el uso de los softwares de comparación de secuencias (ej: BLAST, CLUSTAL). Es fundamental, por tanto, que el biólogo forense se familiarice con las herramientas que la bioinformática pone a nuestra disposición.

Una base de datos biológica es una lista de datos persistentes larga y organizada, asociada generalmente a un software automatizado diseñado para actualizar, buscar y recuperar los datos almacenados dentro del sistema. Actualmente existen organismos que proporcionan bases de datos gratuitas para que los usuarios las puedan utilizar a través de Internet. Uno de los organismos que más ha desarrollado las bases de datos biológicas y las herramientas bioinformáticas es el NCBI (National Center for Biotechnology

Information). Este organismo dispone de una página web

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) muy útil que y que la mayoría de investigadores del campo de la genómica y la proteómica manejan habitualmente. El NCBI tiene múltiples bases de datos biológicas (de secuencias, de proteínas, de genomas, taxonómica, de publicaciones, etc) ligadas entre sí, de tal forma que se puede usar un único sistema de búsqueda y recuperación de datos llamado

ENTREZ. Este sistema de búsqueda permite que un usuario tenga acceso y

recupere información de muchas bases de datos a la vez. Por ejemplo, la base de datos de secuencias de ADN Entrez está ligada a la base de datos de taxonomía Entrez. Esto permite al investigador encontrar información

taxonómica de la especie a la que pertenece la secuencia.

Otro de los recursos que ofrece el NCBI y que más se utilizan en biología forense es el software BLAST (Basical Logical Alignment Search Tool). Entre otras aplicaciones este software ofrece la posibilidad de comparar la secuencia

que hemos obtenido en el laboratorio con las secuencias presentes en las bases de datos de manera automática.

Aunque las bases de datos de ADN están en constante crecimiento, para ciertos organismos no existen datos de las secuencias que nos interesan. Como consecuencia de esto, el éxito en la identificación del origen de una muestra forense no humana depende en gran medida de la disponibilidad de la secuencia de interés en la base de datos. Sin embargo, este problema puede superarse cuando en la base de datos existen secuencias de especies relacionadas con nuestra muestra problema o tenemos idea de qué especie puede tratarse mediante datos no genéticos del caso en cuestión (por ejemplo, el análisis de pelos encontrados en un vehículo involucrado en el robo de abrigos de visón). En estas situaciones podemos recurrir al análisis de una muestra indubitada de la especie que sospechamos y a la comparación de dicha muestra de referencia con nuestra muestra problema.

Por otro lado, no es extraño que tanto cytb, como 12S y 16S presenten cierto nivel de polimorfismo, lo cual complica la interpretación de los resultados. Así, secuencias similares en un 98% de sus nucleótidos pueden derivarse tanto de distintos miembros de la misma especie como de dos especies estrechamente relacionadas que se han separado recientemente.

En ocasiones el problema que se nos plantea es comprobar si los restos biológicos encontrados en el lugar de los hechos coinciden en cuanto a especie con los restos encontrados en, por ejemplo, las ropas de un sospechoso. En los casos en los que no tenemos idea de a qué tipo de organismo pueden pertenecer o el posible organismo está pobremente caracterizado a nivel genético en las bases de datos, podemos recurrir al análisis de sus ADNs por medio de RAPDs (random amplified polimorphic DNA). La técnica consiste en el desarrollo de una reacción PCR en la que los primers se han diseñado al azar. Estos primers de corta longitud (8-12 nucleótidos) anillan en diferentes regiones del genoma del organismo problema generando productos amplificados al azar de diferente longitud. Los fragmentos pueden separarse mediante electroforesis dando un patrón de bandas característico de la especie.

Muchos laboratorios forenses españoles tienen ya la tecnología necesaria para el análisis de los fragmentos mitocondriales cytb, 12S o 16S.

Sin embargo queda mucho trabajo por hacer en identificaciones de restos vegetales o de microorganismos. Sin duda, la genética forense no humana es una nueva puerta que se abre para responder a las preguntas aquí expuestas, pero el campo es tan amplio que se necesitarán grandes inversiones para satisfacer tan amplia demanda.