Desde 1965, Jackson define la antibiosis como la condición por la
cual uno o más metabolitos son excretados por un organismo y
tiene efecto dañino sobre otro o más organismos; al respecto,
Handelsman y Parke (1989) restringen la definición sólo a aquellas
interacciones que involucran a compuestos difusibles de bajo peso
molecular o un antibiótico producido por un microorganismo que
inhiba el desarrollo de otro, esta definición excluye a proteínas y
(1995) extienden el alcance de esta definición a “inhibición o
destrucción de un organismo por la producción metabólica de
otro”, que incluye, enzimas hidrolíticas, metabolitos secundarios
volátiles y pequeñas moléculas tóxicas.
Los antibióticos son considerados generalmente compuestos orgánicos de bajo peso molecular producidos por microbios principalmente habitantes del suelo, los cuales al ser purificados son aplicados como plaguicidas en el control de enfermedades, tienen función de biocontrol en la naturaleza. Los factores que influyen su producción son nutrientes, temperatura, pH y el potencial de agua (Knudsen et al., 1997). A veces los ensayos in vitro de antibiosis no se correlacionan en campo, afortunadamente la mayoría si lo hace; sin embargo, cuando la antibiosis se da por una enzima podría no ser detectada in vitro por la ausencia del sustrato de la enzima, en este sentido, Postmaster, Kuo, Sivasithamparam y Turner (1997), reportan a levaduras que no mostraron antagonismo in vitro pero si in vivo contra Colletotrichum
musae (Berk. & Curtis) Arx, sobre discos foliares de plátano, principalmente cuando
se aplica primero al antagonista.
La producción de metabolitos tóxicos a hongos para utilizarse como agentes de biocontrol se reporta constantemente en las ultimas 5 décadas (Bryan y McGowan, 1945; Dennis y Webster, 1971a; Ghrisalberti y Sivacithamparam, 1991; Ordentlich, Weisman, Gottlieb, Cojocaru y Chet, 1992). Sin embargo, no existe suficiente evidencia de la contribución en la supresión del patógeno en el sitio. El potencial de la antibiosis puede también tener efectos nocivos, se ha observado que hay un ligero efecto de fitotoxicidad sobre la germinación de trigo, lechuga, chicharo y colsa por T.
viride, Aspergillus sp., Fusarium sp. y Penicillium sp. Además un efecto perjudicial,
sobre microorganismos benéficos, particularmente de hongos ectomicorrízicos (Fravel, 1988).
El impacto de la antibiosis en el control biológico es incierto aún en los casos donde la producción de metabolitos antifúngicos reducen la enfermedad, otros mecanismos pueden también estar operando (Baker y Griffin 1995). La antibiosis en Trichoderma spp., puede efectuarse por la producción de enzimas hidrolíticas y por metabolitos secundarios, volátiles o no (Jensen y Wolffhechel, 1995).
2.4.2.1. Por enzimas hidrolíticas
La producción de enzimas hidrolíticas de T. harzianum depende de la composición del medio donde se desarrolla no de la concentración del inóculo. Un medio económico consiste en solución mineral salina, quitina y sucrosa al 0.5% permite obtener altos rendimientos de conidios y enzimas; de esta forma, se obtiene biomasa para el CB y enzimas quitinolíticas (Tronsmo y Harman, 1992).
La mayoría de los hongos patógenos en su pared celular contienen quitina y β-1-3- glucanos y la disolución o daño de esos polímeros estructurales tiene efecto adverso sobre el desarrollo y diferenciación de tales hongos; en particular, la pared celular de los Basidiomycetes y Ascomycetes contienen principalmente quitina y β-glucanos (Inbar y Chet, 1997) mientras que en los Phycomycetes (Oomycetes) es de β- glucanos, celulosa y muy poca cantidad de quitina (menor al 1.0% en Pythium). La quitina en la pared celular del hongo se presenta como una capa microfibrilar primaria o como un complejo interior de capas con glucanos y proteínas (Benhamou y Chet, 1997).
Se sabe de la capacidad de las especies de Trichoderma de producir enzimas hidrolíticas; entre ellas, celulasas, quitinasas, glucanasas (Bruce et al., 1995), proteasas y xylanasas, las cuales en presencia del patógeno incrementan su actividad. Los aislados de Trichoderma spp. hidrolizan la gelatina, caseína, leche, carboximetilcelulosa y la quitina, lo que indica la presencia de actividad de enzimas hidrolíticas de carácter proteolítico, celulolítico y quitinolítico (Stefanova y Sandoval, 1995). Las celulasas son usadas en la industria del papel; las quitinolíticas,
glucanolíticas y algunas veces las proteolíticas, están implicadas en los mecanismos de biocontrol y pueden inhibir la proliferación de fitopatógenos (Noronha y Ulhoa, 1996; Samuels, 1996; Elad y Kapat, 1999).
La inducción de las enzimas quitinolíticas en Trichoderma es la fase inicial de reconocimiento, es la primera etapa en la cascada de eventos que presentaran en la actividad parasítica del antagonista (Inbar y Chet, 1995).
El método basado en la actividad de enzimas hidrolíticas del antagonista, también se utiliza en Trichoderma pero no es garantía, ya que a veces no hay correlación de actividad in vitro e in vivo (Knudsen et al., 1997). Cabe mencionar que entre los microorganismos antagónicos (levaduras, hongos y bacterias) contra C. musae sobre discos foliares de plátano, las levaduras no mostran antagonismo in vitro pero sí in vivo. Generalmente la infección se reduce cuando se aplica primero al antagonista y después al patógeno (Postmaster et al., 1997).
La quitina es un homopolímero no ramificado de 1,4-β-enlazado con N-acetil-D- glucosamina y es el principal componente de la pared celular de la mayoría de los hongos fitopatógenos. Además de la quitina el esqueleto de la pared celular de los hongos filamentosos contiene 1,3-β-glucanos, proteínas y lípidos (Hunsley y Burnett, 1970). Las quitinasas son capaces de hidrolizar la pared celular de hongos que contienen quitina y se piensa, por lo tanto, participan de manera importante en la respuesta de las plantas. Una de las estrategias para incrementar la tolerancia de las plantas hacia patógenos lo constituye la sobreexpresión de proteínas involucradas en los mecanismos de defensa de las plantas (Schickler y Chet, 1997).
Las quitinasas (poli[1,4 (N-acetilglucosaminidasa)] glicanohidrolasa) son proteínas abundantes encontradas en gran variedad de semillas, a pesar de que la función de las quitinasas ha sido aclarada, hay una fuerte evidencia de que son proteínas de defensa con actividad antifúngica; las enzimas quitinolíticas de T. harzianum en
comparación con otras son más efectivas que las de plantas y bacterias contra un rango amplio de patógenos de plantas (Magolles-Clark et al., 1996).
Generalmente se producen cantidades moderadas de enzimas quitinolíticas, el aislamiento del gene ThEn-42 que codifica a endoquitinasa, abre posibles estudios de eficiencia en el hospedero, así como de aplicación (Magolles-Clark et al., 1996). Lla expresión diferencial de quitinasas puede influenciar el conjunto de habilidad antagónica contra un huésped específico (Inbar y Chet, 1997; Schickler, Danin- Gehali, Haran y Chet, 1998).
El sistema quitinolítico del agente de biocontrol T. harzianum está integrado por dos β-1,4-N-acetilglucosaminidasas (CHIT 102 y 74) y cuatro endoquitinasas (CHIT 52, 42, 33 y 31) el cual está finamente regulado y sincronizado, no es un prender-apagar el hospedero afecta dicha regulación específica durante la interacción y define cuál de las 6 se expresa primero y así sucesivamente todas las demás (Haran, Schickler, Oppenheim y Chet, 1995 y 1996; Woo et al., 1999).
Por la producción de varias enzimas hidrolíticas, particularmente quitinasas que destruyen la pared celular del fitopatógeno. T. harzianum antagoniza en campo a
Crinipellis perniciosa (Stahel) el agente causal de la escoba de bruja del cacao (De
Marco, Lima, Sousa y Felix, 2000); también T. viride mostró ser parásito de hifas de
C. perniciosa, reportándolo como posible agente de control biológico de ésta
enfermedad (Bastos, 1996).
Las β-1,3-glucanasas son enzimas que hidrolizan los enlaces glucosídicos de las cadenas de β-1,3-glucanos, las cuales han sido caracterizadas de hongos, plantas y bacterias (Pan, Ye y Kuc´, 1992). La degradación de los glucanos por hongos es frecuentemente acompañada por una acción sinergística de ambas endo y exo β- 1,3-glucanasas, de hecho en la mayoría de los casos β-1,3-glucanasas más bien se encuentran como una sola enzima.
Las enzimas β-1,3 y β-1,6-glucanolíticas son producidas por diferentes cepas de
Trichoderma spp. las cuales dependen de las diferentes fuentes de carbono (Lorito,
Hayes, Di Pietro, Woo y Harman, 1994). T. harzianum IM1206040 secreta β-1,3- glucanasas en presencia de diferentes polímeros de glucosa y paredes celulares de hongos, los niveles secretados son proporcionales a la cantidad de inductores (glucosa y paredes celulares) o laminarina (un β-1,3-glucano soluble). Esta enzima participa en la lisis de la pared celular del huésped durante el micoparasitismo (Vázquez-Garcidueñas, Leal-Morales y Herrera-Estrella, 1998). Mediante técnicas con electroforesis, se detecta la presencia de β-1,6-glucanasas producidas bajo diferentes condiciones de crecimiento (Soler, De la Cruz y Llobell, 1999).
Cuando se aplica Trichoderma longibrachiatum Rifai transformado o modificado en la expresión enzimática de endoglucanasas a semillas de pepino, en suelos infestados con P. ultimum controla mejor que las cepas no transformadas (Migheli, González-Candelas, Dealessi, Camponogara y Ramón-Vidal, 1998).
La cantidad de quitinasas, glucanasas, xilanasas y celulasas producidas por los diferentes microorganismos antagónicos es variable y no siempre está relacionada con la habilidad para controlar enfermedades. No se presenta correlación entre la producción de enzimas que degradan la pared celular y el biocontrol de la enfermedad que inhiba la germinación de esporangios de P. ultimum y conidios de R.
solani (Worasatit, et al., 1994). En este sentido, Lorito et al. (1994), reportan efectos
inhibitorios de enzimas quitinolíticas y glucanolíticas de T. harzianum sobre la germinación de esporas de B. cinerea conforme se incrementa la concentración enzimática; individualmente se necesitó de 200 a 600 μg/ml para inhibir completamente y se manifestó un efecto sinergístico en la mezcla de enzimas quitinolíticas y gluicanolíticas.
Hadar, Chet y Henis (1979) reportan mayor producción de glucanasas que de quitinasas por T. harzianum, de la misma forma que a mayor cantidad del hongo adicionado al suelo se manifestaba una reducción de R. solani y la enfermedad en
condiciones de invernadero. En forma similar, Bruce et al. (1995) utilizando 4 especies diferentes de Trichoderma y 10 cepas reporta mayor producción de glucanasas que de quitinasas y valores muy diferentes aún entre cepas de la misma especie. Los rangos de producción de glucanasas oscilaron entre 0.38 y 5.33 μmol de glucosa/h/μg proteína y de quitinasas de 0.001 a 0.720 μmol N- acetilglucosamina/h/μg proteína. En este sentido, Soler et al., (1999) evaluaron producción de cepas de T. harzianum en cuanto a su producción de glucanasas con valores que variaron de 0.3 a 6.6 .
A mayor producción de quitinasas, glucanasas, celulasas y glucosa oxidasa producidas por el hongo antagónico Talaromyces flavus es mayor el porcentaje de micoparasitismo sobre S. rolfsii y por consiguiente la reducción de la enfermedad; sin embargo, al correlacionar actividad enzimática de las diferentes enzimas y el micoparasitismo sólo encontraron correlación significativa y positiva con quitinasas
in vitro (Madi et al., 1997).
2.4.2.2. Por metabolitos secundarios
La actividad antagónica de T. (=Gliocladium) virens se debe a la producción de “Gliotoxina” y “Viridina” cuya síntesis se reliza en un periodo muy corto de 16 horas durante su crecimiento, coagula el protoplasma de P. ultimum y en presencia de este compuesto no crece (Howell, Stipanovic y Lumsden, 1993; Wilhite y Straney, 1996); además, de este metabolito produce Pacibasina, Trichodermina y otros antibióticos y enzimas que han demostrado que participan en la reducción del inóculo de los fitopatógenos.
Se reportan nuevos metabolitos obtenidos de T. harzianum , entre ellos la Furanona (Ordentlich et al., 1992), las Trichorziaminas que es un metabolito secundario peptídico con efectos antibióticos (Horvath, Burgel y Messner, 1995; Correa, Roquebert y Bettucci, 1996) y capaces de producir cambios en el patrón morfogenético del micelio de S. rolfsii y del propio T. harzianum, lo cual se
considera como una ausencia de inmunidad (Correa et al., 1995). La cantidad de Trichorzianinas esta correlacionada con la inhibición de algunos basidiomycetes, a mayor producción, mayor inhibición (Horvath et al., 1995).
La antibiosis por metabolitos secundarios volátiles recibe menor atención que los no volátiles, T. harzianum produce un metabolito volátil identificado como alquil pirona, es capaz de inhibir in vitro a muchos hongos, entre ellos a R. solani (Fravel, 1988). Existen dos metabolitos con estructura de lactona descritos por Turner y Aldridge (1983), citado por Pavlovicova (1998), uno el 6-(Pent-1-enil)-α-pirona y el otro el 6- pentil-α-pirona (6PAP).
El 6PAP es un agente saborizante no tóxico que fue originalmente sintetizado para propósitos industriales antes de descubrirlo en la naturaleza. Posteriormente se encontró como una esencia natural de los duraznos y extractos de T. viride (Cutler, Cox, Crumley y Cole, 1986). Esta lactona esta presente también en frutos como durazno (Sevenants y Jennings, 1971), lo cual lo hace útil para la aromatización de artículos alimenticios; están ampliamente distribuidas en la naturaleza, se han identificado más de 120 compuestos, los cuales son importantes para la industria del alimento y aroma (Dufossé Latrasse y Spinnler, 1994).
Entre las lactonas saturadas el 6PAP ha sido el más estudiado y se caracteriza por su aroma a coco (Cutler y Hill, 1994), se le conoce como un metabolito volátil biosintetisado por especies de hongos del género Trichoderma (Collins y Halim, 1972; Kalyani, Prapulla y Karanth, 2000) y asociado a propiedades antibióticas y su toxicidad esta relacionada con su habilidad hidrofóbica, formando una capa hidrorepelente sobre la pared celular, que impide la absorción de agua por la celula del hongo (Scarselletti y Faull, 1994).
Entre los metabolitos que produce Trichoderma spp. el 6PAP es de los más conocidos (Collins y Halim, 1972; Cutler et al., 1986) y estudiado debido a su potente actividad antifúngica (Cutler y Hill, 1994). La habilidad de las cepas de
Trichoderma para producirlo es muy variada entre las diferentes especies, aún entre
cepas de la misma especie; además, una cepa en particular puede producir diferentes metabolitos a diferentes estados de desarrollo según las condiciones de cultivo (Cooney, Lauren, Jensen y Perry-Meyer, 1997a; Cooney y Lauren, 1999). Desde el punto de vista químico (http://www.chemfinder.camsoft.com) el 6PAP tiene los siguientes sinónimos: 6-amil-α-pirona y 5-hidroxi-2-4-ácido decanoico delta- lactona; sus características son: olor a coco, líquido de color amarillo a naranja, densidad 1.004, número cas: 27593-23-3; peso molecular 166..22, fórmula molecular C10H14O2 y la siguiente estructura condensada:
CH
3(CH
2)
3CH
2El 6PAP mostró ser promisorio in vitro y también in vivo en el control de muchos hongos en Nueva Zelanda, entre ellos Armillaria, Botritis y Phytophthora (Cutler y Hill, 1994), es tóxico a un número de fitopatógenos y ha demostrado ser efectivo en tratamientos tópicos en el control de B. cinerea causando pudrición en kiwi bajo condiciones de almacén (Poole y Whitmore, 1997; Poole, Ward y Whitaker, 1998); además, aplicado en la superficie del suelo controla la enfermedad causada por
Athelia rolfsii en semillas y plántulas de lenteja sin tener efecto fitotóxico (Dodd, Hill,
y Stewart, 2000).
In vitro el 6PAP producido por T. harzianum IMI 288012 con dosis de 0.3 mg/ml en
el medio de cultivo redujo el 69.6% el crecimiento de R. solani y 31.7% de Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici después de 2 días. A dosis de 0.45 mg/ml inhibe
completamente la germinación de esporas; sin embargo, cuando se lavaron las esporas éstas germinaron en 100% por lo que se perdió el efecto inhibitorio, esto
indica que tiene actividad fungistatica y no funguicida. Es evidente una fuerte relación entre la producción del 6PAP y la habilidad del hongo (Scarselletti y Faull, 1994). Como parte de la investigación del modo de acción de Trichoderma en el CB de fitopatógenos, Cooney, Lauren y Perry-Meyer, (1997) indican que es necesario cuantificar la producción local y la concentración de los químicos del antagónico en la interface Trichoderma-Patógeno, para lo cual utiliza una nueva técnica con minitubos. Cuando Trichoderma crecia sólo la producción de 6PAP en el sitio es muy pequeña; sin embargo, se incrementaba significativamente cuando crecía cerca de
B. cinerea. A pesar de que Trichoderma spp. produce niveles variados del metabolito
en respuesta a la presencia del fitopatógeno, la técnica de los minitubos utilizada provee un sistema útil para probar el efecto de antibiosis en estudios in vivo.
Entre mayor sea la concentración del 6PAP producido por Trichoderma spp. se incrementa el porcentaje de inhibición in vitro de Cylindrocladium floridans Sob. & C.P. Seym. que causa pudriciones en plántulas de coníferas, a concentraciones de 50 ppm lo inhibe ligeramente mientras que a 500 ppm lo hace totalmente con acción fungistática y a 1000 ppm tiene acción fungicida; además, no sólo inhibe el crecimiento del micelio sino que también la producción de microesclerosios (Dumas,
et al., 1996). A concentraciones de 220 ppm inhibe totalmente el crecimiento in vitro
de B. cinerea (Bonnarme et al., 1997).
Las propiedades antibióticas del 6PAP de Trichoderma spp., están en función de su producción y entre mayor cantidad, se incrementa la habilidad para inhibir el crecimiento de B. cinerea y la germinación de conidios al 100% con dosis de 0.25 mg/ml (Poole et al., 1998; Peste et al., 1999).