Scenario 1: One-hop parallel distributed computation

11.3.5.8.1. Preparación de las muestras.

En todas las experiencias se partió de lOg de salchichón.. La muestra, junto con 50 ml de agua destilada y 0,5 ml de una disolución en HCI 0,2N de norleucina de concentración lOmg/ml (estándar interno), se trituró en un homogeneizador “Polytron” hasta que adquirió una consistencia semiliquida.. Se midió el volumen alcanzado y se centrifugó a 6500 x g durante 6 minutos a 40C. El líquido sobrenadante se filtró a través de papel Whatman n2 2.

Una parte alícuota (10 mI) del sobrenadante se precipitó con 10 ml de una solución de ácido sulfosalicílico al 10% y se dejó en reposo durante 17 horas a 40C. De esta manera se consiguió la precipitación de la mayoría de los compuestos nitrogenados, permaneciendo los aminoácidos libres en disolución. El sobrenadante se filtró a través de papel Whatman n2 2 y se tomaron 10 ml. Después se ajustó el pH a 7 con NaOH, teniendo siempre en cuenta el volumen añadido para la realización de los cálculos.

11.3.5.8.2.. Preparación de la solución vatrón de aminoácidos Las soluciones patrón se prepararon a partir de productos “Sigma”.

Se utilizaron aquellos aminoácidos que están presentes naturalmente en la came, es decir, las formas L de ácido aspártico, ácido glutámico, hidroxiprolina, asparagina, serna, glicina, glutamina, histidina, treonina, alanina, prolina, arginina, cisteina, tirosina, valina, metionina, isoleucina, leucina, fenilalanina, triptófano y lisina, más el aminoácido utilizado como estándar interno (norleucina). La solución patrón se preparó disolviendo la cantidad adecuada de cada uno de ellos en una solución de HCl 0,2 N para obtener una concentración

final de 1 mg/ml.

La solución patrón de L-norleucina (estándar interno) se preparó de igual forma, pero la concentración final fue de 10 mg/ml.

Materiales y métodos

11.3.5.8.3. Derivación de los aminoácidos

La obtención de los derivados de los aminoácidos se realizó siguiendo el método descrito por Yang y Sepúlveda (1985> con algunas modificaciones.

La solución de marcado se preparó, inmediatamente antes de su uso, con alcohol etílico absoluto, trietilamina y fenilisotiocianato en proporción 7:2:1. La derivación de los aminoácidos se realizó de la siguiente forma: se mezclaron 200 gí de la solución de marcado con 20~xl de la muestra preparada como se ha descrito en 11.3.5.8.1. De igual forma se derivó

la disolución patrón todos los días en que se realizó la cromatografía.

La mezcla se agitó y se dejó reposar durante 10 minutos y después se evaporó hasta sequedad en corriente de nitrógeno en un baño de agua a 520C durante 20-30 minutos (Beaver y col.., 1987). Más tarde se procedió a la resuspensión de los derivados en SOOgl de tampón fosfato 0,5 M, pH 7,4 con 5% de acetonitrilo para el patrón y en 200 gí para las muestras.

Antes de su inyección en el cromatógrafo, tanto las muestras como los patrones, se filtraron a través de filtros “Millipore” de 0,45¡.tm de tamaño de poro y se conservaron en refrigeración hasta su uso. Finalmente, se inyectaron 20 ~Ilen el cromatógrafo.

II.3..5.8.4. Cromatoerafía de los aminoácidos

Los aminoácidos se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en un cromatógrafo “Beckman” mod.. 3390 provisto de un programador mcd.. 420, dos bombas mod. 110 y un detector de luz ultravioleta mod. 160. El cromatógrafo estaba conectado a un registrador-integrador “Hewlett-Packard” mod.. 3394. Se emplearon columnas metálicas rellenas de Pellicular ODS-2 sobre Spherisorb sumistradas por la firma “Synxta” y columnas rellenas de Supelcosil LC-18, de “Supelco”. Ambos tipos de columna tenían un tamaño de partícula de Si.tm y unas dimesiones de 4,6x250 mm.. La columna se termostató incluyéndola en un dispositivo de vidrio diseñado por la autora a tal fin. El dispositivo contenía en ambos extremos sendos conductos para la. circulación de agua impulsada por un baño termo stado..

Materiales y métodos

11.3.5.8.5.. Disoluciones empleadas en el análisis de los aminoácidos

llJ~j~

Disolvente A: Acetato sádico 0,03 M, pH 6,8, con 0,05% de trietilamina(y/y).

Disolvente B: Acetonitrilo y agua (90/10) (y/y).

El agua destilada necesaria para preparar las disoluciones se obtuvo en un sistema de purificación de agua “Mihi-Q” de Millipore.

Los rectivos utilizados fueron calidad HPLC y se desgasificaron antes de su utilización por ultrasonicación en un aparato “Bransonic” mod. 42, efectuando vacío mediante una bomba “Eyela” mod.. A-36.

Las disoluciones de sustancias inorgánicas se filtraron a través de filtros “Millipore” HA y 0,45p.tm de diámetro de poro y las orgánicas a través de filtros “Míllipore” FH y 0,50j.tm.

11.3.5.8.6. Condiciones cromatom~4ficas

La fase móvil estaba formada por una mezcla del disolvente A y el disolvente B (su composición puede verse en 11.3.5.8.5).

La elución comenzó con un flujo de la fase móvil de lmI/min y el gradiente de elución se inició con un porcentaje de la solución B del 4%, alcanzando a los 32 minutos el 38,5%. Después se fue incrementando hasta el 99% y l,5m1/min de flujo en 5 minutos, manteniéndose estas condiciones durante otros 15 minutos. Desde los 52 a los 57 minutos el flujo se redujo a lmI/min y el porcentaje de la solución B descendió a un 4%. Estas condiciones permenecieron constantes hasta los 67 minutos, restableciéndose así las condiciones iniciales de la cromatografía. La separación se efectuó a una temperatura constante de 350C,

La detección se realizó con un detector ultravioleta a una longitud de onda de 254 nm.

11.3.5.8.7.. Identificación ycuantificación de los aminoácidos

La identificación de los aminoácidos se realizó basándose en los tiempos de retención

Materiales y métodos

de los aminoácidos analizados. Estos tiempos se compararon con los obtenidos con los

aminoácidos patrones cromatografiados en iguales condiciones.

La cuantificación se realizó basándose en que la concentración de cada uno de los aminoácidos separados y detectados a partir de la muestra es proporcional al área comprendida dentro del pico correspondiente obtenido en el cromatograma.

Se calculó un factor de respuesta para cada aminoácido en los patrones empleados en la calibración de la siguiente forma:

FR= Api/Apa

donde,

FR =factor de respuesta para el aminoácido correspondiente.

Api= area correspondiente al estándar interno (L-norleucina) en el cromatograma de

la disolución patrón..

Apa= area correspondiente al aminoácido en el cromatograma de la disolución parrón. La concentración de cadaaminoácido en la muestra analizada se determinó aplicando la siguiente expresión:

Aminoácido «tg/g) = Fr x Ama x Cpi x 1000/ Anipi x M

donde,

Fr= Factor de respuesta para cada aminoácido

Ama= Area de cada aminoácido en la muestra

Cpi= Concentración del estándar interno en la muestra (~.tg)

Ampi= Area del estándar ñnemo en la muestra

M=p.g de muestra de embutido en el volumen inyectado

Los resultados se expresaron finalmente en mg de aminoácido por 100 gramos de extracto seco.

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Materiales y métodos