SDA models

El genoma del adenovirus, transfectado directamente en células permisivas, permite la generación de nuevos viriones sin la necesidad de su cápside proteica [150]. Ello ha facilitado desarrollar técnicas y protocolos para la generación de nuevos vectores adenovirales con múltiples modificaciones genéticas. Básicamente, se pueden diferenciar tres protocolos de construcción del genoma adenoviral: la ligación directa in vitro, la recombinación homóloga en células HEK293 y la recombinación homóloga en bacterias [151].

3.1. LIGACIÓN DIRECTA IN VITRO.

El primer protocolo utilizado para la construcción de vectores adenovirales fue el sistema de ligación directa in vitro con bacterias. Este sistema consiste en la clonación directa, mediante ligación, del fragmento de interés (gen o secuencia de ADN) en un plásmido que contiene el genoma del adenovirus. Aunque simple, este método presenta gran dificultad ya que son escasas las dianas de restricción únicas localizadas en el genoma viral. Además, la clonación de fragmentos pequeños de ADN (0.5-3 Kpb) en plásmidos grandes (35-36 Kpb) es muy poco eficiente. El método de ligación directa requiere, frecuentemente, el uso del ensayo en placa para el aislamiento de clones positivos, debido a que muchos de los genomas amplificados suelen resultar adenovirus salvajes o por otro lado, nulos en cuanto a la expresión del transgén clonado.

3.2. RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA EN CÉLULAS HEK293

Debido a la gran dificultad que comportaba el método de la ligación directa in vitro con genomas de alto peso molecular, en 1981, Stow diseñó un nuevo método para la construcción de genomas adenovirales [152]. Posteriormente, en 1994, Graham y colaboradores mejoraron el método basándose en el uso de dos plásmidos [153], el primer plásmido contenía todo el genoma viral a excepción del gen E1 y la señal de empaquetamiento, y el segundo plásmido (lanzadera) conteniendo un ITR, la señal de empaquetamiento y una secuencia

homóloga al primer plásmido. Una vez se ha clonado el gen de interés en el plásmido lanzadera, ambos plásmidos se co-transfectan en células HEK293 para la generación del vector.

3.3. RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA EN BACTERIAS

Este método está basado en la recombinación homóloga de dos plásmidos, en forma lineal, utilizando la cepa de E. coli BJ5183 (recBCsbcBC) que permite realizar la recombinación homóloga entre los dos fragmentos [154, 155]. El plásmido que contiene el genoma adenoviral presenta dos dianas de restricción (PacI ó PmeI), las cuales flanquean el origen de replicación del plásmido y una resistencia a antibiótico. De este modo, al abrir el plásmido por PacI ó PmeI, se libera el genoma, en forma lineal, para ser transfectado en células permisivas (HEK293). El segundo plásmido contiene el extremo 5’ del genoma viral con el extremo ITR, la señal de empaquetamiento y una región homóloga al genoma viral correspondiente a 3-4 Kpb de la región E2. En este segundo plásmido lanzadera se clonan los genes o fragmentos de interés. Una vez comprobada la inserción del fragmento en el plásmido lanzadera, ambos plásmidos son digeridos por enzimas de restricción y co-transformados en E. coli BJ5183 donde se lleva a cabo la recombinación homóloga.

3.4. TITULACIÓN DEL VECTOR ADENOVIRAL

En el caso de los vectores adenovirales, las unidades de mayor relevancia son las partículas físicas y las unidades infecciosas. Generalmente, el título físico (PP: Physical particles) se cuantifica midiendo la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 260 nm después de la lisis del virión [156, 157]. Con este método se cuantifica la cantidad de genomas virales que contiene una preparación.

El título infeccioso, en Ad de 1ª y 2ª generación, es la concentración de partículas capaces de infectar células HEK293 y causar efecto citopático in vitro. Este valor suele expresarse en IU/mL. El ratio PP/IU es una medida

importante ya que representa la fracción de virus que es infecciosa. La FDA recomienda un ratio menor de 30:1 para realizar ensayos clínicos [158].

Cabe destacar que uno de los inconvenientes asociados a la titulación de vectores adenovirales es la estandarización de protocolos para la determinación del título físico e infeccioso. Diferentes grupos de investigación pueden utilizar diferentes métodos de cuantificación, los cuales dificultan la comparación de resultados entre laboratorios. Además, el título puede variar en función de las condiciones de almacenaje y stock, de la línea celular utilizada y del clon de cada laboratorio [159-161]. Uno de los errores clásicos es el uso del coeficiente del extinción molar del genoma de Ad salvaje, el cual contiene un genoma de 35.9 Kpb [162, 163]. El coeficiente de extinción molar varía en función del tamaño que presente el genoma del vector. Si no se toman en cuenta estos factores, la cuantificación del título de la muestra puede variar considerablemente.

Por ello, en el campo del adenovirus se han intentado evitar todos estos inconvenientes asociados a la titulación de vectores gracias al uso del material de referencia adenoviral (ARM) [164]. El ARM es una preparación de adenovirus humano de serotipo 5 totalmente caracterizada. Su título físico es de 5.8E11 PP/mL y su título infeccioso de 7E10 IU/mL. El ratio PP/IU es de 8.3:1.

En el caso de los adenovirus gutless, al no contener ninguna región viral codificante, no producen efecto citopático, con lo que, en ausencia de genes marcadores, no es posible determinar su título infeccioso. Gracias al ARM se puede extrapolar el título infeccioso por la co-infección de ambas muestras en placa. En primer lugar se cuantifica el número de partículas físicas de ambos vectores por Southern Blot. A posteriori, se co-infectan ambos vectores en células HEK293 y se extrae el ADN celular a las 4 horas tras la infección para realizar la misma técnica de Southern Blot. De este modo, con la técnica de Southern Blot podemos cuantificar el título infeccioso del vector gutless comparándolo con el título del ARM y su título físico [165].