3.7 Research ethical considerations
4.1.2 Section B: The effects of skills development training programmes on the
2.1 Agua residual del tratamiento de post-cosecha de flores sensibles al etileno
La recolección de muestras de agua residual industrial se realizó en las fincas del Grupo Esmeralda - Hilsea Investments – Quinche – Provincia de Pichincha. Las muestras conteniendo tiosulfato de plata fueron recolectadas en botellones plásticos de 4 L, etiquetadas y transportadas al laboratorio Revista Semestral de la Escuela Politécnica del Ejército, Sangolquí - Ecuador 38
para su posterior análisis. Para evitar la precipitación de la plata, las muestras se conservaron en un área oscura a temperatura ambiente. En la Tabla 1 se resume los componentes de las aguas residuales de pos-cosecha.
2.2 Recolección, aislamiento e incubación de microorganismos
Las bacterias nativas fueron aisladas de distintos lugares de la serranía ecuatoriana; una de las cepas fue recuperada de aguas sulfurosas del volcán Tungurahua (Tungurahua 1), otra del sector de Sillunchi y la tercera de la zona denominada La Calera en Machachi (Calera). Estas tres cepas bacterianas locales conjuntamente con la bacteria Thiobacillus thioparus (American Type Culture Collection: ATCC 23645) fueron incubadas en erlenmeyers en el medio de cultivo Thiobacillus ATCC 290S6, compuesto por: (g L-1) Na2HPO4, 1.2; KH2PO4, 1.8; MgSO4.7H2O, 0.1; (NH4)2SO4,
0.1; CaCl2, 0.03; FeCl3, 0.02; MnSO4, 0.02; Na2S2O3, 10.0 y disuelto en 1 L de agua
desmineralizada (ATCC 2007). Las bacterias también fueron propagadas en cajas petri adicionando al medio de cultivo Thiobacillus ATCC 290 S6 15.0 g L-1 de agar (ATCC 2007); y, finalmente en erlenmeyers con el medio de cultivo líquido para Thiobacillus compuesto de: (g L-1) KH
2PO4, 4.0;
MgSO4 . 7H2O, 0.5; (NH4)2SO4, 0.4; CaCl2, 0.25; FeCl3, 0.01; Na2S2O3, 5.0; azul de bromotimol,
0.005; que se disolvió en 1 L de agua desmineralizada (Carter & Gregorich 2007); ajustando el pH a 7.0 para los tres medios de cultivo. Posteriormente, los medios fueron esterilizados a 121ºC, a una atmósfera de presión por 15 min, y posteriormente se dispensaron asépticamente 50 mL del medio líquido en erlenmeyers de 125 mL previamente esterilizados y 20 mL del medio sólido en cajas petri también esterilizadas. Los inóculos en el medio de cultivo sólido fueron colocados en una incubadora Barnstead®, Modelo 100, a 30ºC durante seis días y los inóculos en medio de cultivo líquido permanecieron en agitación a 150 rpm a temperatura ambiente por seis días, en un agitador orbital Heidolph®, Modelo 1010. En cambio, los hongos se recolectaron en cajas conteniendo el medio PDA + cloranfenicol. Posteriormente, las cajas fueron conservadas durante cinco días en una zona oscura a temperatura ambiente. La identificación morfológica de la cepa (Cladosporium cladosporioides) se realizó microscópicamente y por observación directa. Se tomaron muestras de colonias que presentaron forma redonda, color verde oliváceo en la parte anterior y color negro en la parte posterior. A continuación, las muestras fueron sembradas con ayuda de un asa bacteriológica en tubos con medio PDA y fueron incubadas a temperatura ambiente durante ochos días. Para la visualización de las estructuras morfológicas de la cepa fúngica aislada, se prepararon microcultivos. La cepa identificada como C. cladosporioides fue mantenida en tubos con medio PDA + cloranfenicol.
2.3 Evaluación del crecimiento bacteriano
Se utilizó el método turbidimétrico para determinar la curva de crecimiento bacteriano. Las mediciones de la turbidez se condujeron en un espectrofotómetro UV, marca Perkin Elmer Paragon, a λ= 600 nm. Con este propósito, se inoculó 1,0 mL de cultivo en 100 mL de medio y el contenido se mantuvo agitándose a 120 rpm y 150 rpm. El ensayo se realizó a temperatura ambiente durante 10 d. Diariamente se tomó una muestra y se determinó la concentración de oxígeno disuelto. Para establecer el crecimiento se utilizó la curva de calibración MacFarland modificada. El blanco fue el medio de cultivo.
Tabla 1. Composición de aguas residuales de pos-cosecha.
Muestras pH Temperatura, °C SO42-, mg/L Ag+, mg/L
Proceso Lilium 7.28 21.9 65.00 0.04
Flores de verano 3.33 22.4 53.64 93.04
Aguas finales 6.31 20.2 324.56 0.34
2.4 Formación de hongos pelletizados
Para la formación de pellets de hongos se utilizaron dos medios de cultivo: i) Czapeck y ii) medio para C. cladosporioides. La cepa aislada, se inoculó en cada medio de cultivo e incubó a 28 ± 2ºC con agitación a 150 rpm hasta lograr la formación de estructuras esféricas de aproximadamente 3 mm de diámetro luego 11 a 17 d de incubación. Posteriormente, los medios conteniendo las estructuras esféricas fueron filtrados y pesados.
2.5 Amplificación de la secuencia 16S rDNA
La amplificación de la secuencia 16S rDNA en las bacterias aisladas de ambientes ecuatorianos fue llevada a cabo utilizado primer específicos para T. thioparus Ttp194f, Ttp223f, Ttp240r y Ttp833r, muestras de ADN de T. thioparus ATCC 23645 (control+) y de las bacterias Calera y Tungurahua 1, en el termociclador Techne TC - 512 Modelo FTC51H2D. El volumen de reacción seleccionado fue de 25 µL con un contenido de 0.8 ng de muestra, 1.5 U de Taq polimerasa, 2.5 µL de Buffer 10X, MgCl2 1.5 mM (concentración final), 10 pmol de cada primer (forward - reverse), dNTPs 0.3
mM (concentración final mezcla) y agua grado PCR hasta completar el volumen final. 2.6 Análisis filogenéticos de las secuencias nucleotídicas
Varias muestras de ADN fueron enviadas a la empresa MACROGEN INC., Corea, para la obtención de la secuencia nucleotídica de la región 16S rDNA de las bacterias Calera y Tungurahua 1. Una vez recibidas las secuencias, se procedió a compararlas con el banco de datos de secuencias del National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando la aplicación en línea Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Posteriormente, se crearon los árboles filogenéticos de las bacterias Calera y Tungurahua 1 utilizando el método Neighbor Joining del NCBI (NCBI 2008). Con las secuencias nucleotídicas de la región 16S rDNA de las dos bacterias nativas y de las cepas bacterianas que más se asemejan según BLAST, se procedió a alinearlas usando la aplicación ClustalW Multiple Alignment del software bioinformático BioEdit v7.0.8.0 (Hall 1999). Finalmente, las secuencias alineadas fueron utilizadas en la construcción de los árboles filogenéticos individuales para las bacterias nativas CALERA y TUNGURAHUA 1. Adicionalmente, se construyó un árbol filogenético general en el que se incluye a las dos bacterias nativas con ayuda del software bioinformático Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) v4.0, utilizando el método Neighbor Joining (Tamura et al. 2007).
2.7 Ensayos de oxidación del tiosulfato de plata con agua sintética y agua residual industrial Los ensayos de laboratorio se condujeron en mini-reactores tipo lote conteniendo varios volúmenes agua sintética (con STS + 10 mg/L de ácido cítrico) y agua residual proveniente del período de post-cosecha (con STS + biocida + ácido cítrico). Las muestras fueron inoculadas con diferentes volúmenes de las cepas aisladas de Sillunchi, Calera, zona del volcán Tungurahua y T. thioparus, ATCC 23645. Los ensayos de oxidación se condujeron a temperatura ambiente, pH de 6.5 para agua sintética y pH menor a 5.0 para agua residual industrial, agitación de 40 rpm y en períodos de cuatro, cinco, seis y siete días. En todos los ensayos se utilizó un blanco. Muestras de los reactores fueron luego centrifugadas a 3000 rpm durante 30 min para remover bacterias y partículas insolubles y en el sobrenadante se analizó el contenido de tiosulfato, sulfato y plata.
2.8 Ensayos de biosorción con hongos pelletizados
Volúmenes de 100 y 200 mL de soluciones acuosas conteniendo de 5 a 500 mg L-1 de plata a pH =
6 fueron puestos en contacto con 0,25 y 0,5 g de hongos pelletizados (hongos de 11 y 17 d de incubación) durante tres días y con agitación a 40 rpm. La concentración en equilibrio del metal en los hongos fue calculada mediante la siguiente ecuación:
) C (Ci m V qeq = − eq (1)
En la Ec. 1, qeq es la concentración en equilibrio de la plata en los hongos pelletizados (mg g-1),
V volumen de la solución (mL), Ci la concentración inicial de la plata en solución (mg L-1), Ceq
concentración en fase líquida del metal en equilibrio (mg L-1) y m masa del biosorbente (g). Con los datos calculados de qeq y los valores de Ceq, se obtuvieron las isotermas de adsorción, empleando los
modelos linealizados de Freundlich y Langmuir. eq max max eq q e C Q 1 Q b. 1 q C + = (2) Ecuación de Langmuir q e eq
n
lnC
1
K
ln
lnq
=
+
Ecuación de Freundlich (3)En la Ec. 2, b es la constante de Langmuir, Qmax la capacidad máxima de sorción (mg g-1) y en la
Ec. 3, lnK, la intercepción con el eje de las ordenadas que proporciona la capacidad del adsorbente y 1/n la pendiente que proporciona la intensidad de sorción.
2.9 Regeneración de los hongos pelletizados
La regeneración de los hongos se condujo usando una solución regenerante de HNO3- 4N. Con este
propósito, se añadieron 100 mL de la solución regenerante en mini-reactores de plástico y luego se agregaron 0,25 g de hongos pelletizados concentrados con plata. Los mini-reactores luego se colocaron en un agitador rotatorio a 40 rpm durante 24 h. Para cuantificar la cantidad de plata, que se recuperó durante la regeneración, se procedió a filtrar el sobrenadante y a medir el catión utilizando espectrometría de absorción atómica.
2.10 Fotorreducción de la plata
La fotorredución de la plata, se condujo en vasos de precipitación de 250 mL y con 50 mL de solución regenerante usada. Los ensayos de condujeron con diversas concentraciones del catión plata, distintas dosis de óxido de titanio (TiO2: elemento catalizador) y 0,01N de NaNO3 (agente
estabilizante). El contenido de los vasos fue irradiado en cuarto oscuro con una lámpara UV marca SYLVANIA de 15 W de potencia y con una longitud de onda de 254 nm durante 24 h. A continuación, el contenido se trasladó a tubos falcom de 50 mL y se centrifugó a 1500 rpm en una centrifuga marca IEC HN-SII por 15 min. Para cuantificar la cantidad de plata que se transformó en metal, se realizaron mediciones en el sobrenadante y en el extracto de la digestión ácida del precipitado de TiO2. Ambas muestras líquidas fueron analizadas con espectrometría de absorción
atómica.
2.11 Análisis químicos
La concentración de tiosulfato fue determinada mediante el método iodométrico. Con este fin, muestras de agua con tiosulfato de plata se titularon con 10 mL de ioduro de potasio (10% v/v), 15 mL de ácido sulfúrico (2N), 25 mL de bicromato de potasio (0,1 N) e indicador de almidón al 1%. El tiosulfato de sodio a 0.1 N fue usado como estándar. El cambio de rojo ladrillo a amarillo pajizo indicó el momento de adicionar el indicador. La solución se tornó azul luego de agregar el indicador y el cambio de ésta a transparente, indicó el final de la titulación (AOAC 1990, Pethkar & Paknikar 2002). La concentración de sulfato fue medida utilizando el método 4500-SO42- del Standard
Methods (Greenberg et al. 1998). La concentración del catión plata fue analizada usando un espectrómetro de absorción atómica (Perkin Elmer AA100 a λ = 338,3 nm). Antes de medir los contenidos de plata en las muestras reales, el equipo se calibró utilizando cuatro estándares: 2,5; Revista Semestral de la Escuela Politécnica del Ejército, Sangolquí - Ecuador 41
5,0; 8,0 y 10,0 mg L-1 de Ag+. De acuerdo al método utilizado fue necesario pretratar a las muestras
y los estándares con ácido nítrico al 5%.