Sequencing Technology Issues

Como ya se ha comentado, la actividad PI3K es muy relevante en el control de la apoptosis y de la división y proliferación celular. La sobreexpresión o hiperactivación de las PI3K de Clase I así como la pérdida de la regulación de alguno de los elementos que componen la ruta de señalización en la que interviene esta quinasa y que impliquen un incremento en los niveles de PtdIns-3,4,5P3, están íntimamente relacionados con la aparición y la progresión de tumores en mamíferos (Hemmings y Restuccia, 2012; Martini et al., 2013). Además las alteraciones en la regulación de esta ruta también contribuyen a la aparición de otras patologías. De hecho, se ha relacionado a las isoformas PI3Kγ y δ, mayoritariamente expresadas en leucocitos, con la alergia y la inflamación, la artritis reumatoide y la aterosclerosis (Ghigo et al., 2010). A nivel de los cardiomiocitos la hiperactivación de la ruta promueve la hipertrofia cardíaca, lo que acaba ocasionando una reducción de la capacidad contráctil del músculo cardíaco (Aoyagi y Matsui, 2011). La señalización mediada por esta ruta está también

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directamente relacionada con la hiperinsulinemia, obesidad, enfermedad metabólica y diabetes, dado que la insulina media sus efectos a través de la interacción con receptores RTKs que estimulan a PI3K (Schultze et al., 2012; Vucenik y Stains, 2012; Braccini et al., 2012).

Con respecto a la implicación de esta ruta en la oncogénesis, las principales alteraciones moleculares que conllevan un aumento en la señalización a través de la ruta PI3K/Akt y que confieren, en base a las funciones que ésta regula en la célula, ventajas a las células tumorales para su proliferación y supervivencia quedan recogidas en la Tabla 2.

La hiperactivación de la ruta se puede producir al nivel de los receptores; en ocasiones los RTKs pueden hallarse mutados, amplificados o sobreexpresados. Por ejemplo, se han aislado mutaciones somáticas de ganancia de función en el receptor EGF-R (Epidermal Growth Factor Receptor) en tumores de pulmón, entre los que un 27,54% contienen mutaciones en este receptor (COSMIC, Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer,

http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). También es muy común la amplificación o sobreexpresión de HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2) en tumores de mama, hasta en un 30%, lo cual ocasiona la activación de la ruta (Arpino et al., 2004; De Laurentiis et al., 2005; Ellis et al., 2006).

En cuanto a la alteración de la propia PI3K, hasta el momento la subunidad catalítica de Clase I y, dentro de esta, la isoforma p110α es la que presenta una mayor implicación en tumorigénesis (Zhang et al., 2003; Samuels et al., 2004; Steelman et al., 2011; McCubrey et al., 2012; Myers et al., 2012). La pérdida de regulación es normalmente la consecuencia de la aparición de mutaciones de ganancia de función en el gen PIK3CA, que codifica para la subunidad catalítica de la PI3Kα. Existen dos regiones calientes (“hot spot”) en los exones que codifican respectivamente para el dominio helicoidal y para el dominio quinasa donde se concentran la mayor parte de las mutaciones somáticas en el gen PIK3CA que confieren una ganancia de función. De éstas, las más prevalentes entre las que se localizan en el primero son E542K y E545K, y ambas implican la pérdida de interacción entre el dominio N-terminal SH2 de la subunidad reguladora p85α y la p110α (Kang et al., 2005; Miled et al., 2007). Más frecuente aún es la mutación oncogénica H1047R, que se localiza en el dominio quinasa y parece inducir un cambio alostérico en

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Gen (Proteína) Alteración molecular Tejido Referencia

ERBB2 (HER2) Amplificación o sobreexpresión Mama (Arpino et al., 2004; De Laurentiis et al., 2005; Ellis et al., 2006)

EGFR (E-GFR) Mutación de ganancia de función Pulmón COSMIC

Amplificación Mama (Arpino et al., 2004; De Laurentiis et al., 2005; Ellis et al., 2006)

PIK3CA(p110α) Mutación de ganancia de función Mama, endometrio, tracto urinario

COSMIC

Amplificación Ovario (Shayesteh et al., 1999) PIK3CB(p110β) Sobreexpresión Próstata (Zhu et al., 2008; Lee et al.,

2010) PIK3CD(p110δ) Sobreexpresión Leucemia linfocítica crónica,

mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin

(Tzenaki y Papakonstanti, 2013)

PIK3CD(p110γ) Sobreexpresión Leucemia aguda linfoblástica

(Subramaniam et al., 2012)

PIK3R1(p85α,p5 5α,p50α)

Mutaciones activadoras que eliminan el efecto inhibitorio que ejerce la subunidad regulatoria sobre la catalítica

Endometrio , colon, cérvix COSMIC; (Jaiswal et al., 2009; Urick et al., 2011; Cheung et al., 2011)

PIK3R2(p85β) Mutaciones activadoras que eliminan el efecto inhibitorio que ejerce la subunidad regulatoria sobre la catalítica

Estómago; endometrio COSMIC; (Cheung et al., 2011)

PTEN (PTEN) Mutación de pérdida de función Vulva, endometrio sistema nervioso central, piel, colon, próstata

COSMIC

Deleción Próstata (Krohn et al., 2012) Disminución de la expresión por

regulación epigenética

(Garcia et al., 2004; Goel et al., 2004)

KRAS (K-Ras) Mutación de ganancia de función Páncreas, intestino, tracto biliar, pulmón

COSMIC

AKT1(Akt1) Mutación de ganancia de función Mama, tracto urinario, tiroides y colon

COSMIC

AKT2(Akt2) Amplificación Ovario (Cheng et al., 1992;Bellacosa et al., 1995)

AKT3(Akt3) Mutación de ganancia de función Melanoma COSMIC (Davies et al., 2008) Amplificación Mama, ovario COSMIC

Tabla 2. Alteraciones moleculares más frecuentes relacionadas con una hiperactivación de la ruta PI3K-Akt en cáncer y los tejidos en que se presentan.

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la proteína que mimetiza la unión con Ras-GTP (Zhao y Vogt, 2008; Burke et al., 2012). Estas mutaciones implican una ganancia en la actividad lípido quinasa de la proteína (Carson et al., 2008). También se han hallado una serie de mutaciones en el dominio ABD que implican una ganancia en la actividad catalítica de la proteína y no afectan a la interacción de p85α con p110α, así como otras de escasa frecuencia distribuidas a lo largo de la proteína (COSMIC). Las mutaciones de ganancia de función en este gen estánimplicadas en el desarrollo del 24,8% de los tumores de mama, 22,48% de endometrio, 17,5% de tracto urinario y 13,5% de colon (COSMIC). Por otro lado, la amplificación del gen PIK3CA se ha descrito como un mecanismo de hiperactivación de la ruta hasta en el 40% de los tumores de ovario (Shayesteh et al., 1999).

Con respecto al papel en cáncer de las otras isoformas de la subunidad catalítica de PI3K, p110β, p110δ y p110γ, no se han encontrado mutaciones oncogénicas en clínica, pese a que se ha descrito que su sobreexpresión induce transformación oncogénica en cultivos celulares (Kang et al., 2006). Hay datos que sugieren una relevancia de la isoforma p110β en la transformación que se produce en tumores en los que existe una previa deficiencia en PTEN (Jia et al., 2008; Wee et al., 2008). La expresión de la isoforma p110δ se ha encontrado incrementada en enfermedades proliferativas de las células sanguíneas, tales como leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple o linfoma de Hodgkin (Tzenaki et al., 2013), por el importante papel que desempeña en éstas.Se ha establecido recientemente la implicación de la sobreexpresión de la isoforma p110γ también en enfermedades sanguíneas, como la leucemia aguda linfoblástica (Subramaniam et al., 2012), así como un posible papel en la metástasis en cáncer de mama (Xie et al., 2013).

Pese a que es menos frecuente, la subunidad regulatoria p85α también está implicada en la oncogénesis causada por hiperactivación de la ruta. Existen mutaciones en el gen que codifica esta proteína, PIK3R1, que eliminan el efecto inhibitorio que ejerce esta subunidad regulatoria sobre la catalítica y que se han encontrado en cáncer de endometrio (15%), colon (6,7%) y cérvix (3,7%) (COSMIC). Asimismo se ha descrito la existencia de una versión truncada en un linfoma humano, p76, que carece del dominio cSH2 (Jucker et al., 2002), lo que pone de manifiesto la importancia del mecanismo de inhibición y estabilización de la subunidad regulatoria sobre la catalítica. Se han aislado

29 mutaciones en el gen PIK3R2, que codifica la subunidad regulatoria p85β, en tumores de estómago (4,17%) y de endometrio (1,32%) (COSMIC).

La principal alteración de esta ruta que produce la transformación oncogénica de las células es la pérdida de actividad fosfatasa de la proteína PTEN, que regula negativamente los niveles de PtdIns-3,4,5P3. Se han encontrado mutaciones en PTEN en el 50% de tumores de vulva, en el 38% de endometrio, en el 15% en sistema nervioso central, 12% de piel, 11,4% de colon y 10,5% de próstata, entre otros muchos (COSMIC). Las mutaciones germinales se presentan muy frecuentemente en ciertos tipos de tumores hereditarios; de hecho alrededor del 60–80% de pacientes con PHTSs (PTEN Hamartoma Tumour Syndrome), como la enfermedad de Cowden, presentan mutaciones de este tipo (Aguissa-Toure y Li, 2012). Éstas son principalmente mutaciones de cambio de sentido que afectan al dominio fosfatasa (Orloff y Eng, 2008), aunque también se han descrito otras que alteran la ubiquitinación de PTEN preservando su actividad catalítica (Trotman et al., 2007). Sin embargo, la mayor parte de las alteraciones genéticas en tumores esporádicos son mutaciones somáticas de pérdida de función de la proteína, que se localizan frecuentemente en el dominio responsable de su actividad fosfatasa. Es común la pérdida alélica de una de las copias del gen en un 30% de los casos en que existe alteración en este gen (Singh et al., 1998).Además existen alteraciones epigenéticas, como la hipermetilación del promotor, que conlleva una disminución en la expresión de PTEN (Garcia et al., 2004a).

La hiperactivación de la ruta se puede producir también a nivel de la proteína Ras que, como se ha mencionado, además de ejercer una gran variedad de funciones en la célula de mamífero, regula positivamente la actividad de PI3K. El gen que codifica la proteína K-Ras (KRAS) presenta un papel establecido como oncogén en numerosos tumores (Baines et al., 2011); las mutaciones de ganancia de función en este oncogén se presentan en el 57% de los tumores de páncreas, 37,50% de los tumores de colon, 27% de vías biliares y 21% de intestino delgado, entre otros muchos (COSMIC). La subunidad catalítica p110α está directamente implicada en la transformación ejercida por estas versiones oncogénicas de Ras (Castellano y Downward, 2010). Su contribución a la transformación oncogénica en este contexto se demostró en modelos animales en que un mutante de p110α incapaz de interaccionar con una versión oncogénica de Ras no desarrollaba el proceso tumorigénico (Gupta et al., 2007).

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Existen también mutaciones somáticas de ganancia de función en los genes que codifican las tres isoformas de Akt, AKT1, AKT2 y AKT3, relacionadas con procesos oncogénicos. La presencia de mutaciones en el gen AKT1 se ha encontrado en tumores de mama (3,53%), tracto urinario (2,73%), tiroides (2,48%) y colon (1,14%) (COSMIC). Es frecuente la aparición de la sustitución E17K en el dominio PH de Akt1, la cual hace que se localice en mayor medida en la membrana plasmática por aumentar la afinidad en la unión con el PtdIns-3,4,5P3 (Carpten et al., 2007). La amplificación de AKT2 se ha descrito en tumores de mama y ovario (Cheng et al., 1992; Bellacosa et al., 1995). Recientemente se han hallado mutaciones de ganancia de función en el gen AKT3 en melanomas (Davies et al., 2008) y su amplificación en tumores de mama (64%) y ovario (44%) (COSMIC).

Las alteraciones descritas se pueden producir además de forma concurrente en varios de los elementos implicados en la señalización de la ruta en el mismo tumor. Por ejemplo, se ha descrito que aproximadamente el 24% de los tumores de colon contienen mutaciones en KRAS y en PIK3CA (Parsons et al., 2005); estas dos mutaciones también se presentan de manera conjunta en tumores de endometrio, tiroides y en leucemia linfoblástica aguda (Yeang et al., 2008; Xing, 2010). Algunos tumores pancreáticos contienen mutaciones en KRAS y amplificaciones en AKT2 (Tuveson y Hingorani, 2005). También se han hallado mutaciones en el gen PTEN que co-existen con mutaciones en PIK3CA en un porcentaje significativo de tumores (Perez-Tenorio et al., 2007).