Para validar los resultados anteriores nos propusimos analizar la presencia de CA150 en un DNA cromatinizado usando para ello la línea celular Jurkat-(LTR-Tat-GFP)/clon8 descrita en el apartado 1.6 de esta sección.
Hemos considerado de interés señalar en la memoria que durante el desarrollo de la técnica ChIP se observó que el procedimiento estándar de sonicación de los extractos producía la degradación de CA150 en las muestras fijadas. La reactividad del anticuerpo específico para CA150 en las muestras fijadas y sonicadas detectaba la desaparición de la banda correspondiente a la proteína y la aparición de un nuevo producto reactivo de menor tamaño (Figura 28A). Esta degradación parece específica de proteínas de elevado peso molecular ya que, además de CA150, la RNAPII tuvo un comportamiento similar mientras que proteínas de menor tamaño como CDK9 o la TBP permanecían inalterables (Figura 28A). Para aclarar la diferencia observada, se realizaron diferentes ensayos de sonicación sobre los lisados celulares confirmando la posible degradación de proteínas de elevado peso molecular en función de los ciclos de sonicación (Figura 28B).
Figura 28. Efecto de la sonicación sobre la integridad de un extracto previamente fijado. A) Los extractos obtenidos a partir de células que han sufrido una fijación fueron sonicadas siguiendo protocolos estándar, y se analizaron las proteínas indicadas mediante WB antes y después del proceso de sonicación. B) Los extractos obtenidos fueron sonicados y se analizaron las proteínas indicadas tras 5, 10 y 15 ciclos de sonicación estándar.
Dado que el efecto observado podía suponer una limitación a la hora de inmunoprecipitar las proteínas del extracto después de la etapa de sonicación, se examinó el efecto del tampón de lisis celular con respecto a la sonicación. El tampón de lisis usado en los experimentos anteriores es el usado clásicamente en los experimentos de ChIP y contiene SDS al 1 % (tampón SDS). Aunque no se consiguió una protección total de la degradación de proteínas, se obtuvieron resultados aceptables con el tampón RIPA en las condiciones ensayadas (Figura 29). Debido a estos resultados, los experimentos de ChIP se continuaron usando el tampón RIPA para la lisis de las células y posterior sonicación de los extractos.
Figura 29. Comparación del efecto de la sonicación sobre la integridad de un extracto previamente fijado, y lisado con diferente tampón de lisis. Los extractos obtenidos tras la lisis de las células con tampón SDS o tampón RIPA fueron sonicados y se analizaron las proteínas indicadas mediante WB tras 5, 10 y 15 ciclos de sonicación estándar. Se muestra la tinción de ponceau de la membrana de nitrocelulosa realizada después de la transferencia de proteínas.
Los experimentos de ChIP se llevaron a cabo analizando tanto la región próxima al promotor como una región más distal dentro de la zona codificante de la eGFF. La posición de los fragmentos amplificados está esquematizada en la Figura 26A. Se obtuvieron los extractos procedentes de las células que habían sido o no tratadas con PMA y se llevaron a cabo las inmunoprecipitaciones con anticuerpos específicos. En el caso de CA150, se utilizaron dos anticuerpos diferentes, anti-CA150-Suero1 y anti- CA150-AP. El primero corresponde a un suero completo de conejo inmunizado contra CA150; el segundo fue purificado, por afinidad a antígeno, a partir de un suero independiente procedente de animales igualmente inmunizados contra CA150, tal y como se describe en Materiales y Métodos. Esta purificación permitía enriquecer la preparación en inmunoglobulinas específicas contra el antígeno de interés, aumentando a priori la eficacia del ensayo. Como controles del experimento se realizaron inmunoprecipitaciones con anticuerpos para la RNAPII, así como CDK9, Ciclina T1 y Tat. Como controles negativos para los distintos anticuerpos, y de distintas procedencias, se utilizaron, por un lado, inmunoglobulinas de conejo (rIgG, purificadas como se describe en Materiales y Métodos) como control de RNAPII, CDK9 y CA150 (AP); por otro lado, inmunoglobulinas de cabra (gIgG) como control de Ciclina T1; o finalmente suero pre-inmune de conejo como control de CA150 (suero) y Tat.
Los resultados se muestran en la Figura 30B. Tanto en ausencia de estimulación como después de la estimulación con PMA se detectó la presencia de proteínas en la región 5´LTR del VIH-1. Como era de esperar, se detectaron la RNAPII, CDK9, como se había visto anteriormente (Figura 24), y Ciclina T1 en ambos casos. Fue posible detectar también CA150 (Figura 30B, carriles 5,7 y 15,17). Después de la estimulación se detectó también la proteína Tat en la región 5´LTR, sin embargo ésta no se detectó en ausencia de estimulación (Figura 30B, comparar carril 18 y carril 8), ya que en ese caso, no se produce proteína Tat en las células (ver Figura 21). La señal positiva observada tanto en el caso de células estimuladas y sin estimular indica, como se comentó en el apartado 1.6 de esta sección, que ocurre un reclutamiento de factores a dichas regiones en ausencia de la activación transcripcional por PMA; para examinar diferencias en las dos condiciones sería necesario analizar el DNA inmunoprecipitado de manera cuantitativa. Cuando se analizó la presencia de proteínas en la región distal del promotor, en la región codificante de la proteína eGFP, no se detectaron proteínas en ausencia de estimulación; sin embargo, RNAPII, CDK9, Ciclina T1, Tat, y también CA150 se vieron asociadas a esa zona. Asimismo, se amplificaron dos fragmentos como
controles negativos de asociación de la maquinaria transcripcional, una región intergénica y una región exónica del factor OCT-2 específico de linfocitos B. Como ya se había observado previamente (Figura 24), no se detectó la asociación de las proteínas a dichas regiones, añadiendo mayor especificidad a los resultados obtenidos. Estos resultados indican que CA150 se asocia a los complejos transcripcionales tanto en las regiones próximas al promotor del VIH-1 como a complejos que se encuentran en posiciones más distales in vivo.
Figura 30. Análisis por ChIP del reclutamiento de factores de transcripción a construcción derivada del VIH-1 integrada en las células Jurkat. A) Esquema de la región integrada derivada del VIH-1 en las células Jurkat-(LTR-Tat-GFP)/clon8. Se indica la posición de los fragmentos 5´LTR y eGFP amplificados. B) Los extractos preparados a partir de células sin tratar (DMSO) o tratadas con 50 ng/μl de PMA y fijadas, se sonicaron y se inmunoprecipitaron con los anticuerpos indicados. Se purificó el DNA de las muestras y se analizaron los fragmentos obtenidos por PCR, amplificando las regiones correspondientes : la región 5 del LTR viral integrado (posición); la región codificante de la eGFP (posición) una región intergénica 10 kb aguas arriba del promotor P2 del gen c-myc, y una región exónica del gen OCT-2. La señal INPUT (carriles 1 y 11) muestra la amplificación de los fragmentos correspondientes a partir de las muestras antes de la inmunoprecipitación. CA150 (AP) y CA150 (suero) corresponden a dos inmunoprecipitaciones con anticuerpos anti-CA150 diferentes, anticuerpos purificados por afinidad a antígeno, y anticuerpos procedentes de un suero de conejo inmunizado con CA150 (ver Materiales y Métodos).
2.3. Efecto de la depleción de CA150 del extracto nuclear sobre la transcripción